미세주입에 의한 스트 롱실로이드 종에서 형질전환 및 녹아웃 생성

Summary

기생 선충류 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti 에 대한 기능적 게놈 툴킷에는 트랜스제네시스, CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발 및 RNAi가 포함됩니다. 이 프로토콜은 성선 내 미세주사를 사용하여 전이유전자 및 CRISPR 성분을 S. stercoralis 및 S. ratti에 도입하는 방법을 입증할 것이다.

Abstract

Strongyloides 속은 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti를 포함하여 다양한 숙주 범위를 가진 여러 종의 피부 침투 선충류로 구성됩니다. S. stercoralis는 약 610 만 명의 사람들을 감염시키는 인간 기생충, 피부 침투 선충류이며, 쥐 기생충 S. ratti는 S. stercoralis와 밀접한 관련이 있으며 종종 S. stercoralis의 실험실 모델로 사용됩니다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다 성선 내 미세주사의 외인성 핵산 전달 기술을 통해 트랜스제닉 및 녹아웃의 생성에 쉽게 적응할 수 있으며, 따라서 아직이 기술에 적용 가능하지 않은 다른 기생충에 대한 모델 시스템으로 부상했습니다.

기생충 Strongyloides 성인은 숙주의 소장에 서식하며 대변을 통해 자손을 환경으로 방출합니다. 일단 환경에 들어가면, 애벌레는 배설물에 살고 새로운 숙주를 찾아 침략해야하는 자손을 생산하는 자유 생활 성인으로 발전합니다. 이러한 환경 생성은 Strongyloides 종에 고유하며 C. elegans를 위해 개발 된 기술이 성선 내 미세 주사를 포함하여 이러한 기생충 선충류와 함께 사용하도록 적응 될 수있는 모델 자유 살아있는 선충류 Caenorhabditis elegans 와 형태학적으로 충분히 유사합니다 . 성선 내 미세주사를 사용하여, 매우 다양한 전이유전자가 스트롱실로이드에 도입될 수 있다. CRISPR / Cas9 성분은 또한 돌연변이 Strongyloides 애벌레를 만들기 위해 미세 주입 될 수 있습니다. 여기에서, 자유 생존 성인의 제조, 주사 절차 및 트랜스제닉 자손의 선택을 포함하는 스트롱실로이드 로의 성선 내 미세주사의 기술이 기재되어 있다. CRISPR/Cas9 돌연변이유발을 사용하여 만든 형질전환 스트롱실로이드 유충의 이미지가 포함되어 있습니다. 이 논문의 목적은 다른 연구자들이 미세 주입을 사용하여 트랜스제닉 및 돌연변이 스트롱 틸로이드를 만들 수있게하는 것입니다.

Introduction

스트롱실로이드 스테로이드는 더 널리 알려진 갈고리벌레 및 회충 Ascaris lumbricoides¹에 비해 중요한 인간 병원체로서 오랫동안 간과되어 왔다. 웜 부담에 대한 이전의 연구는 종종 S. stercoralis ²에 대한 일반적인 진단 방법의 민감도가 낮기 때문에 S. stercoralis의 유병률을 심각하게 과소 평가했습니다. 최근 몇 년 동안, 개선 된 진단 도구에 기초한 역학 연구는 S. stercoralis 감염의 진정한 유병률이 이전에보고 된 것보다 훨씬 높다고 추정했다⁽전 세계적으로 약 610 만 명).

밀접한 관련이 있는 쥐 기생충과 일반적인 실험실 모델 S. ratti를 포함한 S. stercoralis 및 다른 Strongyloides 종은 모두 기생 및 자유 생활 (환경) 세대 3으로 구성되어 있기 때문에 실험 게놈 연구에 유리한 비정상적인 수명주기^를 가지고 있습니다 (

Protocol

참고 : Gerbils는 S. stercoralis를 통과시키는 데 사용되었고, 쥐는 S. ratti를 통과시키는 데 사용되었습니다. 모든 절차는 AAALAC 표준 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드를 준수하는 UCLA 동물 연구 감독 사무소 (프로토콜 번호 2011-060-21A)의 승인을 받았습니다. 웜 배양, 미세 주입 패드 준비, 미세 주입 믹스 구축, 박테리아 (대장균 HB101)를 6cm 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트⁸에 확산시키는 작업은 적어도 하루 전에 완료해야합니다. 자유 생존 여성은 미세 주입되기 전에 젊은 성인으로 발전하기 위해 25 °C에서 최소 24 시간의 분변 후 수집이 필요합니다. 미세주입 패드는 완전히 건조해야 합니다. 박테리아 판은 건조하고 작은 잔디밭을 만들어야합니다.

1. 미세 주입 슬라이드의 제조 : 적어도 주입 전 하루 전

참고: 웜은 주입을 위해 건조한 한천 패드가 있는 미세주입 커버슬립에 장착됩니다.

1. 히트 블록을 90°C로 설정하십시오.
2. 5 mL의_ddH2O를 첨가한 다음, 100mg의 아가로스를 보....

Results

실험이 성공하면,_F1 유충은 관심있는 전이유전자 및/또는 돌연변이 표현형을 발현할 것이다(그림 4). 그러나 형질전환 속도는 매우 가변적이며 구성물, 웜의 건강, 주사 후 배양 조건 및 실험자의 기술에 따라 다릅니다. 일반적으로, 성공적인 실험은 주입된 암컷 당 >_{15 F1} 유충을 산출하고 형광 마커에 대해 >3%의 형질전환 속도를 산출할 것이다. 살아있는 자손의 총 수가 평균 10 마리 미만의 애벌레 / 암컷이라면, 그 구조는 독성이 있고 변형 된 유충은 생존하지 못할 수 있습니다. 형광 유충이 아닌 많은 수의 형광 알을 발견하는 것은 주사 혼합이 유독 할 수 있다는 또 다른 표시입니다. 이 기술을 처음 학습할 때는 체벽 근육(¹³)에서 강력한 표현을 유도하는 act-2::mRFPmars와 같이 잘 표현되는 구조를 사용하는 것이 좋습니다(

Discussion

이 미세주입 프로토콜 은 S. stercoralis 및 S. ratti에 트랜스제네시스 및 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발을 위한 작제물을 도입하는 방법을 상세 히 기술한다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다에 대해, 주사 후 생존 및 형질감염 또는 돌연변이 유발의 속도는 미세 조정될 수 있는 몇 가지 변수의 적용을 받는다.

성공적인 전이형성을 위한 첫 번째 중요한 고려 사항은 플라스미드 전이유전자가 어떻게 구축되는지입니다. 이전의 연구들은 스트롱실로이드에서 외인성 전이유전자의 발현이 스트롱실로이드 5' 프로모터 및 3' UTR 요소 ^3,13,19의 사용을 필요로 한다는 것을 발견했다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(&빼기;)-니코틴, ≥ 99%(GC), 액체	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	니코틴 마비 웜
3" 철 C-클램프, 3" x 2"(용량 x 깊이)	VWR	470121-790	벤치 탑 설정을 위한 C-클램프
Agarose LE	Phoenix	RBA-500	아가로스
뼈 숯, 4lb 통, 10 x 28 메쉬	Ebonex	n/a	숯 배양용
뼈 숯, 과립, 10 x 28 메쉬	Reade	bonechar10x28	배설물 배양용 숯(위의 대안)
굵은 미세 조작기	Narishige	MMN-1	거친 미세 조작기
Corning Costar Spin-X 원심분리기 튜브 필터	Fisher	07-200-385	마이크로 필터 컬럼
커버 유리, 48 x 60mm, No. 1 두께	Brain Research Lab	4860-1	커버슬립 (48 x 60mm)
깊은 페트리 접시, 6개의 통풍구가 있는 무거운 버전, 직경 100mm	VWR	82050-918	10cm 페트리 접시(배설물 배양용)
Eisco 레토르트 베이스(막대 포함	Fisher	12-000-101	Baermann 장치용 스탠드
Eppendorf FemtoJet 마이크로인젝터 마이크로로더 팁	VWR	89009-310	마이크로주입 바늘 주입
Fisherbrand 흡수성 언더패드	Fisher	14-206-62	벤치 용지(준비용)
Fisherbrand 주철 링	Fisher	14-050CQ	Baermann O-링
Fisherbrand 삼각 폴리프로필렌 비커	Fisher	14-955-111F	플라스틱 비커(혼합용)
Fisherbrand 삼각 폴리프로필렌 비커	Fisher	14-955-111F	플라스틱 비커(캐치 버킷/물 양동이용)
Fisherbrand 삼각 폴리프로필렌 비커	Fisher	14-955-111F	플라스틱 비커(x2)(홀더 제작용)
주사기에 담긴 고릴라 에폭시	McMaster-Carr	7541A51	접착제(튜브 부착용)
할로카본 오일 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	할로카본 오일
식품 및 음료용 고온 실리콘 고무 튜브, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	튜빙 (깔때기 용)
KIMAX 깔때기, 긴 줄기, 60도; 앵글, 킴블 체이스	VWR	89001-414	Baermann 깔때기
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 벤치탑 프로텍터	Fisher	15-235-101	벤치 페이퍼(준비용)
형광이 있는 Leica 실체 현미경	Leica	M165 FC	GFP 형질 전환 웜 식별 및 분류용 실체 현미경
microINJECTOR 황동 스트레이트 암 니들 홀더	Tritech	MINJ-4	마이크로 주입 바늘 홀더
microINJECTOR 시스템	Tritech	MINJ-1	마이크로 주입 시스템
몽골 게르빌스	Charles River Laboratories	213-몽골 게	빌 저빌스 S. stercoralis, 수컷 4-6주
Nasco Whirl-Pak 닫기 쉬운 가방, 18oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak 샘플 가방
나일론 얇은 명주 그물(메쉬)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	Baermann 홀더용 나일론 메쉬
플래티넘 와이어, 36 게이지, 인치당	Thomas Scientific	1233S72	플래티넘/이리듐 와이어 웜 픽용
청교도 혀 압착기, 152mm(L) x 17.5mm(W)	VWR	62505-007	나무 막대기(샘플 혼합용)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN Miniprep Kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	쥐 S. ratti, 암컷 4-6
유지 관리 Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	쥐 S. ratti, 암컷 4-6주 유지 관리
유용한 상자 뚜껑이 있는 반투명 보관 상자, 1.6L 용량, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	가습실
용 플라스틱 상자셰퍼드 테크보드, 8 x 16.5인치	Newco	999589	테크보드
스테인리스 스틸 레이즈드 와이어 바닥	Ancare	R20SSRWF	와이어 케이지 바닥
StalkMarket 퇴비화 가능한 수저 스푼, 6", 흰색, Office	Depot	9587303	스푼
Stender 접시, 스태킹 유형, 37 x 25mm	캐롤라이나(과학)	741012	시계 안경(소, 원형)
실체현미경	Motic	K-400 LED	해부 준비 스코프
보관 토트, 색상 클리어/화이트, 외부 높이 4-7/8인치, 외부 길이 13-5/8인치, 가	습 챔버용	Grainger	53GN16
Sutter P-30 마이크로피펫 풀러 Sutter P-30		/P	바늘 풀러와 백금/이리듐 필라멘트
시러큐스 시계 안경	Fisher	S34826	시계 안경 (대, 원형)
Thermo Scientific Castaloy 고정 각도 클램프	Fisher	05-769-2Q	깔때기 클램프 (2x)
3 축 행잉 조이스틱 오일 하이드로 릭 마이크로 매니퓰레이터	Narishige	MM0-4	미세 미세 매니퓰레이터
United Mohr 핀치 콕 클램프	Fisher	S99422	핀치 클램프 (2x)
통풍이 잘되는 날카로운 가장자리의 페트리 접시 (직경 60mm)	Tritech Research	T3308P	6cm 페트리 접시 (소규모 분변 숯 배양 용)
VWR 경량 티슈 와이퍼	VWR	82003-820	라이닝 Baermann 홀더
시계 유리, 사각형, 1-5/8 인치	캐롤라이나 (과학)	742300	시계 안경 (소, 사각형)
Whatman 품질 등급 일반 원, 1 학년, 직경 5.5 cm	피셔	09-805B	여과지 (6cm 페트리 용) 그릇)
Whatman 품질 등급 일반 원, 1 등급, 직경 9cm	Fisher	09-805D	여과지 (10cm 페트리 접시 용)
World Precision Instrument 붕규산 유리 모세관, 1.2mm x 4 in	Fisher	50-821-813	유리 모세관 마이크로 주입 바늘
X-Acto 나이프, No. 1 나이프 No. 11 블레이드 Office	Depot	238816	X-Acto 나이프 웜 픽을 담을 블레이드가없는 나이프
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	해당 없음	도립 현미경