Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.

Abstract

Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe sind zunehmend attraktiver geworden, da sie geeignete Merkmale aufweisen und eine zugängliche Quelle für regenerative klinische Anwendungen darstellen. Verschiedene Protokolle wurden verwendet, um aus Fett gewonnene Stammzellen zu erhalten. Dieser Artikel beschreibt verschiedene Schritte eines verbesserten zeitsparenden Protokolls, um eine signifikantere Menge an ADSC zu erhalten, und zeigt, wie ADSC kryokonserviert und aufgetaut wird, um lebensfähige Zellen für die Kulturexpansion zu erhalten. Einhundert Milliliter Lipoaspirate wurden mit einer 26 cm langen Dreiloch- und 3-mm-Spritzen-Fettabsaugung aus dem Bauchbereich von neun Patienten entnommen, die sich anschließend einer elektiven Bauchdeckenstraffung unterzogen. Die Isolierung der Stammzellen wurde mit einer Reihe von Wäschen mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) -Lösung, ergänzt mit Kalzium und der Verwendung von Kollagenase, durchgeführt. Zellen der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) wurden kryokonserviert und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Immunphänotypisierung überprüft. Die SVF-Zellausbeute betrug 15,7 x 10⁵ Zellen / ml, zwischen 6,1-26,2 Zellen / ml. Adhärente SVF-Zellen erreichten nach durchschnittlich 7,5 (±4,5) Tagen eine Konfluenz mit einer durchschnittlichen Zellausbeute von 12,3 (± 5,7) x 10⁵ Zellen/ml. Die Lebensfähigkeit von aufgetautem SVF nach 8 Monaten, 1 Jahr und 2 Jahren lag zwischen 23,06% und 72,34% mit einem Durchschnitt von 47,7% (±24,64), wobei die niedrigste Lebensfähigkeit mit Fällen von zweijährigem Einfrieren korrelierte. Die Verwendung von DPBS-Lösung, ergänzt mit Kalzium und Beutelruhezeiten für die Fettfällung mit einer kürzeren Zeit der Kollagenase-Verdauung, führte zu einer erhöhten Zellendausbeute der Stammzellen. Das detaillierte Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten lebensfähiger Stammzellen war in Bezug auf Zeit und Zellertrag effizienter als die Techniken aus früheren Studien. Selbst nach einer langen Zeit der Kryokonservierung wurden lebensfähige ADSC-Zellen im SVF gefunden.

Introduction

Humane mesenchymale Stammzellen sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung von Vorteil. Die Verwendung dieses adulten Zelltyps überwindet ethische Fragen – verglichen mit der Verwendung embryonaler oder anderer Zellen – und ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete in der autologen Geweberegeneration und Zelltherapie¹, wie der neoplastische Bereich, die Behandlung degenerativer Erkrankungen und therapeutische Anwendungen im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie ^{2,3,4, 5}. Es wurde bereits berichtet, dass es eine reichliche Quelle von mesenchymalen multipotenten und pluripotenten Stammzellen in der stromalen vaskulären Zellfraktion des Fettgewebes^{gibt 6,7}. Diese ADSC gelten als hervorragende Kandidaten für den Einsatz in der Zelltherapie und Transplantation/Infusion, da eine beträchtliche Anzahl von Zellen mit einer starken Expansionskapazität ex vivo leicht mit einer hohen Ausbeute aus einem minimalinvasiven Verfahren gewonnen werden kann ^5,8.

Es wurde auch gezeigt, dass Fettgewebe eine größere Fähigkeit zur Bereitstellung mesenchymaler Stammzellen aufweist als zwei andere Quellen (Knochenmark und Nabelschnurgewebe)⁹. ADSC ist nicht nur schlecht immunogen und besitzt eine hohe Fähigkeit, sich in das Wirtsgewebe zu integrieren und mit dem umgebenden Gewebe zu interagieren^4,10, sondern hat auch eine multipotente Fähigkeit zur Differenzierung in Zelllinien, mit Berichten über chondrogene, osteogene und myogene Differenzierung unter geeigneten Kulturbedingungen^11,12,13, und in Zellen wie Pankreas, Hepatozyten^, und neurogene Zellen^14,15,16.

Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist sich einig, dass die immunmodulatorische Wirkung der mesenchymalen Stammzellen ein relevanterer Wirkmechanismus für die Zelltherapie^{ist 17,18,19} als ihre Differenzierungseigenschaft. Einer der wichtigsten Vorteile der ADSC-Verwendung ist die Möglichkeit der autologen Infusion oder Transplantation, die zu einer alternativen Behandlung für mehrere Krankheiten wird. Für die regenerative Medizin wurden ADSC bereits bei Leberschäden, Rekonstruktion des Herzmuskels, Regeneration von Nervengewebe, Verbesserung der Skelettmuskelfunktion, Knochenregeneration, Krebstherapie und Diabetesbehandlung eingesetzt^20,21.

Bis heute gibt es 263 registrierte klinische Studien zur Bewertung des Potenzials von ADSC, die auf der Website der United States National Institutes of Health²² aufgeführt sind. Verschiedene Protokolle zur Entnahme von Fettgewebe wurden etabliert, aber es gibt keinen Konsens in der Literatur über eine standardisierte Methode zur Isolierung von ADSC für den klinischen Gebrauch^23,24. Lipoaspirate-Verarbeitungsmethoden während und nach der Operation können sich direkt auf die Zelllebensfähigkeit, die endgültige Zellausbeute²⁵ und die Qualität der ADSC-Population²⁰ auswirken. In Bezug auf die chirurgische Vorbehandlung ist nicht genau bekannt, welche chirurgische Vorbehandlungstechnik nach der Isolierung eine signifikantere Anzahl lebensfähiger Zellen ergibt oder ob die in das Fettgewebe injizierte Anästhesielösung die Zellausbeute und ihre Funktionen beeinflusst²⁶. In ähnlicher Weise kann der Unterschied zwischen den Techniken zur Gewinnung von Fettzellen zu einer Verringerung der Anzahl lebensfähiger ADSC 20 um bis zu⁷⁰% führen. Nach der Literatur sollten mechanische Behandlungen zur Gewinnung von Zellpopulationen mit hoher Lebensfähigkeit – einschließlich Ultraschall – vermieden werden, da sie das Fettgewebe abbauen können²⁰. Die manuelle Fettaspirationsmethode mit Spritzen ist jedoch weniger schädlich und verursacht weniger Zellzerstörung, wobei die Tumeszenzfettabsaugung eine signifikante Anzahl von Zellen mit der besten Qualität ergibt²⁶.

Diese Technik verwendet eine Kochsalzlösung mit Lidocain und Epinephrin, die in den Fettabsaugungsbereich injiziert wird. Für jedes injizierte 3-ml-Volumen der injizierten Lösung wird 1 ml aspiriert. In dieser Studie wurde die nasse Fettabsaugungstechnik durchgeführt, bei der für jeden injizierten 1 ml Adrenalin und Kochsalzlösung 0,2 ml Fettgewebe abgesaugt werden. Die Verwendung von Verdauungsenzymen, insbesondere Kollagenase, ist für den Prozess der Isolierung von ADSC üblich.

Nach dem ersten Isolationsschritt im Labor wird das endgültige Pellet als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bezeichnet. Es enthält verschiedene Zelltypen²⁷, einschließlich endothelialer Vorläuferzellen, Endothelzellen, Makrophagen, glatter Muskelzellen, Lymphozyten, Perizyten, Präadipozyten und ADSCs, die adhäsionsfähig sind. Sobald die endgültige Isolierung aus In-vitro-Kulturen abgeschlossen ist, werden Zellen, die nicht am Kunststoff haften, im Medienaustausch eliminiert. Nach acht Wochen Expansion, Mediumsveränderungen und Passagen repräsentieren ADSCs den größten Teil der Zellpopulation in den Kolben²⁰. Einer der wichtigsten Vorteile der Verwendung isolierter Stammzellen aus Fettgeweben für eine mögliche zukünftige Therapie ist die Möglichkeit der Kryokonservierung. Es wurde gezeigt, dass kryokonserviertes Lipoaspirate auch nach 6 Wochen des Einfrierens eine potenzielle Quelle von SVF-Zellen ist²⁸, mit biologischer Aktivität auch nach 2 Jahren Kryokonservierung²⁹ und voller Fähigkeit, in Kultur³⁰ zu wachsen und zu differenzieren. Während des Auftauvorgangs geht jedoch in der Regel ein erheblicher Prozentsatz der Zellen verloren³¹. Daher müssen der Prozess der Lipoaspirateentfernung und die folgenden Methoden der Zellisolierung die höchste Zellausbeute gewährleisten.

Diese Studie beschreibt eine schnellere Methodik zur Erfassung und Isolierung von ADSC und zeigt eine hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit für eine bessere Effizienz von Zelltherapeutika. Darüber hinaus wurde die Wirkung dieser verbesserten Technik nach Langzeit-SVF-Kryokonservierung evaluiert.

Protocol

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der UNIFESP genehmigt (Protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), durchgeführt nach schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki (2004). Die Stichprobe der vorliegenden Studie besteht aus neun Patientinnen im Alter von 33 bis 50 Jahren (Durchschnittsalter 41,5 Jahre) und einem durchschnittlichen anfänglichen Body-Mass-Index (BMI) von 24,54 (zwischen 22,32 und 26,77) (Tabelle 1), die sich eine…

Representative Results

Die Charakterisierung der neun untersuchten Personen, einschließlich Alter, Gewicht, Größe und BMI, ist in Tabelle 1 dargestellt. Entsprechend der anfänglich dargestellten Zellausbeute wurde das in Kultur inokulierte Zellvolumen so berechnet, dass es so nah wie möglich an der Kapazität des 75cm2 Kulturkolbens liegt. Das jeweils ausgesäte Probenvolumen ist in Tabelle 2 beschrieben. Dann wurde entsprechend der anfänglichen Zellausbeute ein var…

Discussion

Isolationsausbeute
Es ist allgemein bekannt, dass der Kryokonservierungsprozess, der häufig in der Zelltherapie erforderlich ist, zu einem signifikanten Zellverlust führt, manchmal mehr als 50%29,30,35. Daher ist eine technische Verbesserung zur Erzielung einer hohen anfänglichen Zellausbeute in Isolation von grundlegender Bedeutung. Die Sammelmethode der Lipoaspirate und die Isolierungsmethode der Zellen …

Materials

1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056