Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu
Summary
Mevcut protokol, literatüre kıyasla zaman kazanımı ile muazzam bir hücresel verim ile sonuçlanan ADSC izolasyonu için geliştirilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra nispeten çok sayıda canlı hücre elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Yağ dokusundan elde edilen insan mezenkimal kök hücreleri, uygun özellikler gösterdikleri ve rejeneratif klinik uygulamalar için erişilebilir bir kaynak oldukları için giderek daha çekici hale gelmiştir. Adipoz türevi kök hücreleri elde etmek için farklı protokoller kullanılmıştır. Bu makalede, daha önemli miktarda ADSC elde etmek için geliştirilmiş bir zaman kazandıran protokolün farklı adımları anlatılmakta ve kültür genişlemesi için canlı hücreler elde etmek üzere ADSC’nin nasıl kriyoproteksiyon ve çözüleceği gösterilmektedir. Daha sonra elektif abdominoplasti uygulanan dokuz hastanın karın bölgesinden 26 cm üç delikli ve 3 mm kalibreli şırınga liposuction kullanılarak yüz mililitre lipoaspirat toplandı. Kök hücre izolasyonu, Dulbecco’nun kalsiyum ve kollajenaz kullanımı ile desteklenen Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) çözeltisi ile bir dizi yıkama ile gerçekleştirildi. Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) hücreleri kriyoprezerve edildi ve canlılıkları immünofenotipleme ile kontrol edildi. SVF hücresel verimi 15.7 x 105 hücre/mL idi ve 6.1-26.2 hücre/mL arasında değişiyordu. Yapışkan SVF hücreleri, ortalama 7.5 (±4.5) gün sonra birleşime ulaştı ve ortalama hücresel verim 12.3 (± 5.7) x 105 hücre / mL’dir. Çözülmüş SVF’nin 8 ay, 1 yıl ve 2 yıl sonra yaşayabilirliği %23,06-%72,34 arasında değişmekte olup, ortalama %47,7 (±24,64) arasında değişmekte olup, en düşük canlılık iki yıllık donma vakaları ile ilişkilidir. Daha kısa bir kollajenaz sindirimi süresi ile yağ çökeltmesi için kalsiyum ve torba dinlenme süreleri ile desteklenen DPBS çözeltisinin kullanılması, kök hücre nihai hücresel veriminin artmasına neden olmuştur. Yüksek canlı kök hücre verimi elde etmek için ayrıntılı prosedür, zaman ve hücresel verim açısından önceki çalışmalardan elde edilen tekniklerden daha etkiliydi. Uzun bir kriyoprezervasyon döneminden sonra bile, SVF’de canlı ADSC hücreleri bulundu.
Introduction
İnsan mezenkimal kök hücreleri hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda avantajlıdır. Bu yetişkin hücre tipinin kullanımı, embriyonik veya diğer hücrelerin kullanımına kıyasla etik sorunları aşmaktadır – otolog doku rejenerasyon mühendisliği vehücre terapisinde en umut verici çalışma alanlarından biri olan 1, neoplastik alan, dejeneratif hastalıkların tedavisi ve rekonstrüktif cerrahi alanındaki terapötik uygulamalar 2,3,4, 5. Daha önce yağ dokusunun stromal vasküler hücre fraksiyonunda mezenkimal multipotent ve pluripotent kök hücrelerin bol miktarda bulunduğu bildirilmiştir 6,7. Bu ADSC, hücre tedavisi ve transplantasyon / infüzyonda kullanım için mükemmel adaylar olarak kabul edilir, çünkü ex vivo genişleme için güçlü bir kapasiteye sahip önemli sayıda hücre, minimal invaziv bir prosedürden yüksek verimle kolayca elde edilebilir 5,8.
Ayrıca, yağ dokusunun mezenkimal kök hücre sağlama kapasitesinin diğer iki kaynaktan (kemik iliği ve göbek kordonu dokusu) daha fazla olduğu gösterilmiştir9. Kötü immünojenik olmasının yanı sıra, konakçı dokuya entegre olma ve çevre dokularla etkileşime girme yeteneğinin yüksek olmasının yanı sıra 4,10, ADSC, uygunkültür koşulları altında kondrojenik, osteojenik ve miyojenik farklılaşma raporları ile hücre hatlarına ve pankreas, hepatositler gibi hücrelere çok güçlü bir farklılaşma kapasitesine sahiptir. ve nörojenik hücreler14,15,16.
Bilimsel topluluk, mezenkimal kök hücrelerin immünomodülatör etkisinin, hücre tedavisi içinfarklılaşma özelliklerinden 17,18,19 daha uygun bir etki mekanizması olduğu konusunda hemfikirdir. ADSC kullanımının en önemli yararlarından biri, çeşitli hastalıklar için alternatif bir tedavi haline gelen otolog infüzyon veya aşılama olasılığıdır. Rejeneratif tıp için, ADSC karaciğer hasarı, kalp kasının rekonstrüksiyonu, sinir dokusunun yenilenmesi, iskelet kası fonksiyonunun iyileştirilmesi, kemik rejenerasyonu, kanser tedavisi ve diyabet tedavisi20,21 vakalarında zaten kullanılmıştır.
Bu tarihe kadar, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri 22’nin web sitesinde listelenen ADSC’nin potansiyelinin değerlendirilmesi için263 kayıtlı klinik çalışma bulunmaktadır. Yağ dokusunun toplanması için farklı protokoller oluşturulmuştur, ancak literatürde ADSK’yi klinik kullanım için izole etmek için standartlaştırılmış bir yöntem hakkında fikir birliği yoktur23,24. Ameliyat sırasında ve sonrasında lipoaspirat işleme yöntemleri, hücre canlılığını, nihai hücresel verimi25 ve ADSC popülasyonunun kalitesini20’yi doğrudan etkileyebilir. Cerrahi ön tedavi ile ilgili olarak, hangi cerrahi ön tedavi tekniğinin izolasyondan sonra daha anlamlı sayıda canlı hücre verdiği veya yağ dokusuna enjekte edilen anestezik solüsyonun hücre verimini ve fonksiyonlarını etkileyip etkilemediği iyi belirlenmemiştir26. Benzer şekilde, yağ hücreleri elde etme teknikleri arasındaki fark, canlı ADSC 20 sayısında%70’lik bir azalmaya neden olabilir. Literatüre göre, ultrason da dahil olmak üzere yüksek canlılığa sahip hücre popülasyonlarını elde etmek için mekanik tedavilerden kaçınılmalıdır, çünkü bunlar yağ dokusunu parçalayabilir20. Bununla birlikte, şırıngalarla manuel yağ aspirasyon yöntemi daha az zararlıdır, daha az hücre yıkımına neden olur, tümesan liposuction en iyi kalitede26 ile önemli sayıda hücre verir.
Bu teknik, liposuction bölgesine enjekte edilen lidokain ve epinefrin içeren bir salin çözeltisi kullanır. Enjekte edilen her 3 mL çözelti hacmi için 1 mL aspire edilir. Bu çalışmada, enjekte edilen her 1 mL adrenalin ve salin çözeltisi için 0.2 mL yağ dokusunun aspire edildiği ıslak liposuction tekniği uygulanmıştır. Sindirim enzimlerinin, özellikle kollajenazın kullanımı, ADSC’yi izole etme işlemi için yaygındır.
Laboratuvardaki ilk izolasyon adımından sonra, son pelet stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak adlandırılır. Endotel öncü hücreleri, endotel hücreleri, makrofajlar, düz kas hücreleri, lenfositler, perisitler, pre-adipositler ve adezyon yeteneğine sahip ADSC’ler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri27 içerir. Son izolasyon in vitro kültürlerden tamamlandıktan sonra, plastiğe yapışmayan hücreler orta değişimlerde elimine edilir. Sekiz haftalık genişleme, orta değişiklikler ve pasajlardan sonra, ADSC’ler şişe20’deki hücre popülasyonunun çoğunu temsil eder. Gelecekteki olası bir tedavi için izole adipoz türevi kök hücrelerin kullanılmasının en önemli avantajlarından biri kriyoprezervasyon olasılığıdır. Kriyokorunmuş lipoaspiratın, 6 haftalık donma28’den sonra bile SVF hücrelerinin potansiyel bir kaynağı olduğu, 2 yıllık kriyoprezervasyon29’dan sonra bile biyolojik aktiviteye sahip olduğu ve kültür30’da büyüme ve farklılaşma kabiliyetinin tam olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, çözülme işlemi sırasında, hücrelerin önemli bir yüzdesi genellikle31 oranında kaybolur. Bu nedenle, lipoaspirat çıkarma işlemi ve aşağıdaki hücre izolasyon yöntemleri en yüksek hücre verimini sağlamalıdır.
Bu çalışma, ADSC’yi toplamak ve izole etmek için daha hızlı bir metodolojiyi açıklamakta, hücresel terapötiklerin daha iyi verimliliği için yüksek hücresel verim ve canlılık göstermektedir. Ayrıca, bu gelişmiş tekniğin uzun süreli SVF kriyoprezervasyonundan sonraki etkisi değerlendirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
İzolasyon verimi
Hücresel tedavide sıklıkla gerekli olan kriyoprezervasyon işleminin, bazen %50’den fazla olan önemli hücre kaybına neden olduğu iyi bilinmektedir29,30,35. Bu nedenle, izolasyonda yüksek başlangıç hücresel verimi elde etmek için teknik bir gelişme esastır. Lipoaspiratın toplama yöntemi ve hücrelerin izolasyon yöntemi, hücrelerin uzun vadeli kültürünü ve manipülasyonu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Katılmak için gönüllü olan hastalara ve São Paulo Hastanesi’nin tıbbi ve hemşirelik personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brezilya tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol’Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol’Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- . US National Institutes of Health Website Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019)
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , (2001).
- . Spearman’s Rho Calculator Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020)
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
