Método DE GOTÍcula Digital PCR para quantificação da eficiência de transdução AAV em Murine Retina
Summary
Este protocolo apresenta como quantificar a eficiência de transdução AAV na retina do mouse usando PCR de gotícula digital (dd-PCR) juntamente com produção de AAV de pequena escala, injeção intravitreal, imagem da retina e isolamento do DNA genômico da retina.
Abstract
Muitos laboratórios de biologia de células da retina agora usam rotineiramente vírus associados ao Adeno (AAVs) para edição de genes e aplicações regulatórias. A eficiência da transdução AAV é geralmente crítica, o que afeta os resultados experimentais globais. Um dos principais determinantes para a eficiência da transdução é o sorotipo ou variante do vetor AAV. Atualmente, vários sorotipos e variantes artificiais de AAV estão disponíveis com diferentes afinidades para hospedar receptores de superfície celular. Para a terapia genética da retina, isso resulta em diferentes graus de eficiência de transdução para diferentes tipos de células da retina. Além disso, a rota de injeção e a qualidade da produção de AAV também podem afetar a eficiência de transdução AAV da retina. Portanto, é essencial comparar a eficiência de diferentes variantes, lotes e metodologias. O método digital gotlet PCR (dd-PCR) quantifica os ácidos nucleicos com alta precisão e permite realizar a quantificação absoluta de um determinado alvo sem qualquer padrão ou referência. Usando dd-PCR, também é viável avaliar a eficiência de transdução de AAVs por quantificação absoluta dos números de cópia do genoma AAV dentro de uma retina injetada. Aqui, fornecemos um método simples para quantificar a taxa de transdução de AAVs em células de retina usando dd-PCR. Com pequenas modificações, essa metodologia também pode ser a base para a quantificação do número de cópia do DNA mitocondrial, bem como avaliar a eficiência da edição de base, fundamental para várias doenças da retina e aplicações de terapia genética.
Introduction
Os vírus associados ao Adeno (AAVs) são agora comumente usados para uma variedade de estudos de terapia genética da retina. Os AAVs fornecem uma maneira segura e eficiente de entrega de genes com menos imunogenicidade e menos integrações de genomas. A entrada de AAV na célula alvo ocorre através da endocitose, que requer a ligação de receptores e co-receptores na superfície celular1,2. Portanto, a eficiência de transdução de AAVs para diferentes tipos de células depende principalmente do capsídeo e suas interações com os receptores de células hospedeiras. Os AAVs possuem sorotipos e cada sorotipo pode ter tropismos celulares/tecidos distintos e eficiências de transdução. Há também sorotipos artificiais de AAV e variantes geradas pela modificação química do vírus capsid, produção de capsídeos híbridos, inserção de peptídeos, embaralhamento capsídeo, evolução direcionada e mutagênese racional3. Mesmo pequenas alterações na sequência de aminoácidos ou estrutura capsíide podem influenciar as interações com fatores celulares hospedeiros e resultar em diferentes tropismos4. Além das variantes capsid, outros fatores como a rota de injeção e a variação em lote da produção de AAV podem afetar a eficiência de transdução de AAVs na retina neuronal. Portanto, são necessários métodos confiáveis para a comparação das taxas de transdução para diferentes variantes.
A maioria dos métodos para determinar a eficiência da transdução AAV depende da expressão genética dos repórteres. Estes incluem imagens fluorescentes, imunohistoquímica, mancha ocidental ou análise histoquímica do produto genético repórter5,6,7. No entanto, devido à restrição de tamanho dos AAVs, nem sempre é viável incluir genes de repórteres para monitorar a eficiência de transdução. O uso de promotores fortes como o melhorador de CMV híbrido/frango beta-actin ou woodchuck hepatite pós-transcrição elemento regulatório (WPRE) como uma sequência estabilizadora mRNA complica ainda mais o problema de tamanho8. Portanto, também será benéfico definir a taxa de transdução de AAVs injetados com uma metodologia mais direta.
O PCR de gotícula digital (dd-PCR) é uma técnica poderosa para quantificar o DNA alvo a partir de quantidades minúsculas de amostras. A tecnologia dd-PCR depende do encapsulamento da mistura de dna alvo e reação PCR por gotículas de óleo. Cada reação dd-PCR contém milhares de gotículas. Cada gotícula é processada e analisada como uma reação independente do PCR9. A análise das gotículas permite calcular o número absoluto de cópias de moléculas de DNA alvo em qualquer amostra simplesmente usando o algoritmo Poisson. Como a eficiência de transdução dos AAVs está correlacionada com o número de cópia de genomas AAV na retina neuronal, usamos o método dd-PCR para quantificar genomas AAV.
Aqui, descrevemos uma metodologia dd-PCR para calcular a eficiência de transdução dos vetores AAV a partir do DNA genômico da retina6,10. Primeiro, os AAVs que expressam o repórter tdTomato foram gerados usando o protocolo de pequena escala, e titered pelo método dd-PCR11. Em segundo lugar, os AAVs foram injetados intravitrealmente na retina neuronal. Para demonstrar a eficiência da transdução, primeiro quantificamos a expressão tdTomato usando microscopia fluorescente e software ImageJ. Isso foi seguido pelo isolamento do DNA genômico para a quantificação de genomas AAV em retinas injetadas usando dd-PCR. A comparação dos níveis de expressão tdTomato com os genomas AAV transduzidos quantificados pelo dd-PCR mostrou que o método dd-PCR quantificou com precisão a eficiência de transdução dos vetores AAV. Nossos protocolos demonstraram uma descrição detalhada de uma metodologia baseada em dd-PCR para quantificar a eficiência de transdução AAV. Neste protocolo, também mostramos o número absoluto de genomas AAV que são transduzidos após injeções intravitais simplesmente usando o fator de diluição após o isolamento genômico do DNA e os resultados do DD-PCR. No geral, este protocolo fornece um método poderoso, que seria uma alternativa à expressão dos repórteres para quantificar a eficiência de transdução dos vetores AAV na retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, geramos dois vetores AAV que têm diferentes proteínas capsidas e, em seguida, titered-los em conformidade. Uma das etapas mais cruciais deste protocolo é produzir quantidades suficientes de AAVs que produzirão expressão detectável de repórteres após a transdução12,13.
A titering de AAVs também é um fator importante para ajustar as doses de AAV para injeções intravitais. Uma vez alcançados esses crité…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Oezkan Keles, Josephine Jüttner e prof. Botond Roska, Instituto de Oftalmologia Molecular e Clínica Basel, Plataforma de Vírus Complexos por sua ajuda e apoio à produção de AAV. Também gostaríamos de agradecer ao Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, da Universidade da Pensilvânia pela cepa AAV8/BP2. O trabalho com animais é realizado na unidade de animais da Universidade Técnica gebze. Por isso, agradecemos a Leyla Dikmetas e ao Prof. Uygar Halis Tazebay por assistência técnica e apoio à pecuária. Também gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho é apoiado pela TUBITAK, números de subvenção 118C226 e 121N275, e bolsa de Integração da Universidade sabanci.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
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