Este protocolo apresenta como quantificar a eficiência de transdução AAV na retina do mouse usando PCR de gotícula digital (dd-PCR) juntamente com produção de AAV de pequena escala, injeção intravitreal, imagem da retina e isolamento do DNA genômico da retina.
Muitos laboratórios de biologia de células da retina agora usam rotineiramente vírus associados ao Adeno (AAVs) para edição de genes e aplicações regulatórias. A eficiência da transdução AAV é geralmente crítica, o que afeta os resultados experimentais globais. Um dos principais determinantes para a eficiência da transdução é o sorotipo ou variante do vetor AAV. Atualmente, vários sorotipos e variantes artificiais de AAV estão disponíveis com diferentes afinidades para hospedar receptores de superfície celular. Para a terapia genética da retina, isso resulta em diferentes graus de eficiência de transdução para diferentes tipos de células da retina. Além disso, a rota de injeção e a qualidade da produção de AAV também podem afetar a eficiência de transdução AAV da retina. Portanto, é essencial comparar a eficiência de diferentes variantes, lotes e metodologias. O método digital gotlet PCR (dd-PCR) quantifica os ácidos nucleicos com alta precisão e permite realizar a quantificação absoluta de um determinado alvo sem qualquer padrão ou referência. Usando dd-PCR, também é viável avaliar a eficiência de transdução de AAVs por quantificação absoluta dos números de cópia do genoma AAV dentro de uma retina injetada. Aqui, fornecemos um método simples para quantificar a taxa de transdução de AAVs em células de retina usando dd-PCR. Com pequenas modificações, essa metodologia também pode ser a base para a quantificação do número de cópia do DNA mitocondrial, bem como avaliar a eficiência da edição de base, fundamental para várias doenças da retina e aplicações de terapia genética.
Os vírus associados ao Adeno (AAVs) são agora comumente usados para uma variedade de estudos de terapia genética da retina. Os AAVs fornecem uma maneira segura e eficiente de entrega de genes com menos imunogenicidade e menos integrações de genomas. A entrada de AAV na célula alvo ocorre através da endocitose, que requer a ligação de receptores e co-receptores na superfície celular1,2. Portanto, a eficiência de transdução de AAVs para diferentes tipos de células depende principalmente do capsídeo e suas interações com os receptores de células hospedeiras. Os AAVs possuem sorotipos e cada sorotipo pode ter tropismos celulares/tecidos distintos e eficiências de transdução. Há também sorotipos artificiais de AAV e variantes geradas pela modificação química do vírus capsid, produção de capsídeos híbridos, inserção de peptídeos, embaralhamento capsídeo, evolução direcionada e mutagênese racional3. Mesmo pequenas alterações na sequência de aminoácidos ou estrutura capsíide podem influenciar as interações com fatores celulares hospedeiros e resultar em diferentes tropismos4. Além das variantes capsid, outros fatores como a rota de injeção e a variação em lote da produção de AAV podem afetar a eficiência de transdução de AAVs na retina neuronal. Portanto, são necessários métodos confiáveis para a comparação das taxas de transdução para diferentes variantes.
A maioria dos métodos para determinar a eficiência da transdução AAV depende da expressão genética dos repórteres. Estes incluem imagens fluorescentes, imunohistoquímica, mancha ocidental ou análise histoquímica do produto genético repórter5,6,7. No entanto, devido à restrição de tamanho dos AAVs, nem sempre é viável incluir genes de repórteres para monitorar a eficiência de transdução. O uso de promotores fortes como o melhorador de CMV híbrido/frango beta-actin ou woodchuck hepatite pós-transcrição elemento regulatório (WPRE) como uma sequência estabilizadora mRNA complica ainda mais o problema de tamanho8. Portanto, também será benéfico definir a taxa de transdução de AAVs injetados com uma metodologia mais direta.
O PCR de gotícula digital (dd-PCR) é uma técnica poderosa para quantificar o DNA alvo a partir de quantidades minúsculas de amostras. A tecnologia dd-PCR depende do encapsulamento da mistura de dna alvo e reação PCR por gotículas de óleo. Cada reação dd-PCR contém milhares de gotículas. Cada gotícula é processada e analisada como uma reação independente do PCR9. A análise das gotículas permite calcular o número absoluto de cópias de moléculas de DNA alvo em qualquer amostra simplesmente usando o algoritmo Poisson. Como a eficiência de transdução dos AAVs está correlacionada com o número de cópia de genomas AAV na retina neuronal, usamos o método dd-PCR para quantificar genomas AAV.
Aqui, descrevemos uma metodologia dd-PCR para calcular a eficiência de transdução dos vetores AAV a partir do DNA genômico da retina6,10. Primeiro, os AAVs que expressam o repórter tdTomato foram gerados usando o protocolo de pequena escala, e titered pelo método dd-PCR11. Em segundo lugar, os AAVs foram injetados intravitrealmente na retina neuronal. Para demonstrar a eficiência da transdução, primeiro quantificamos a expressão tdTomato usando microscopia fluorescente e software ImageJ. Isso foi seguido pelo isolamento do DNA genômico para a quantificação de genomas AAV em retinas injetadas usando dd-PCR. A comparação dos níveis de expressão tdTomato com os genomas AAV transduzidos quantificados pelo dd-PCR mostrou que o método dd-PCR quantificou com precisão a eficiência de transdução dos vetores AAV. Nossos protocolos demonstraram uma descrição detalhada de uma metodologia baseada em dd-PCR para quantificar a eficiência de transdução AAV. Neste protocolo, também mostramos o número absoluto de genomas AAV que são transduzidos após injeções intravitais simplesmente usando o fator de diluição após o isolamento genômico do DNA e os resultados do DD-PCR. No geral, este protocolo fornece um método poderoso, que seria uma alternativa à expressão dos repórteres para quantificar a eficiência de transdução dos vetores AAV na retina.
Neste protocolo, geramos dois vetores AAV que têm diferentes proteínas capsidas e, em seguida, titered-los em conformidade. Uma das etapas mais cruciais deste protocolo é produzir quantidades suficientes de AAVs que produzirão expressão detectável de repórteres após a transdução12,13.
A titering de AAVs também é um fator importante para ajustar as doses de AAV para injeções intravitais. Uma vez alcançados esses crité…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Oezkan Keles, Josephine Jüttner e prof. Botond Roska, Instituto de Oftalmologia Molecular e Clínica Basel, Plataforma de Vírus Complexos por sua ajuda e apoio à produção de AAV. Também gostaríamos de agradecer ao Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, da Universidade da Pensilvânia pela cepa AAV8/BP2. O trabalho com animais é realizado na unidade de animais da Universidade Técnica gebze. Por isso, agradecemos a Leyla Dikmetas e ao Prof. Uygar Halis Tazebay por assistência técnica e apoio à pecuária. Também gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho é apoiado pela TUBITAK, números de subvenção 118C226 e 121N275, e bolsa de Integração da Universidade sabanci.
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
Isoflurane | ADEKA ![]() ![]() ![]() ![]() |
N01AB06 | anesthetic |
Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim ![]() ![]() |
S01FA06 | pupil dilation |
Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |