Den nuværende protokol præsenterer en hurtig, effektiv og blid metode til isolering af enkeltceller, der er egnede til encellet RNA-seq-analyse fra et kontinuerligt voksende museæg, musetænder og menneskelige tænder.
Mus og menneskelige tænder repræsenterer udfordrende organer for hurtig og effektiv celleisolation til enkeltcellede transskriptomiske eller andre applikationer. Dental papirmasse væv, rig på den ekstracellulære matrix, kræver en lang og kedelig dissociation proces, der er typisk ud over den rimelige tid for enkeltcellede transcriptomics. For at undgå kunstige ændringer i genekspressionen gik tiden fra aflivningen af et dyr, indtil analysen af enkelte celler skal minimeres. Dette arbejde præsenterer en hurtig protokol, der gør det muligt at opnå enkeltcellet suspension fra mus og menneskelige tænder i en fremragende kvalitet egnet til scRNA-seq (single-cell RNA-sekventering). Denne protokol er baseret på accelererede væv isolation trin, enzymatisk fordøjelse, og efterfølgende forberedelse af endelige encellet suspension. Dette muliggør hurtig og skånsom behandling af væv og gør det muligt at bruge flere dyre- eller menneskeprøver til at opnå celleophæng med høj levedygtighed og minimale transskriptionsmæssige ændringer. Det forventes, at denne protokol kan guide forskere interesseret i at udføre scRNA-seq ikke kun på musen eller menneskelige tænder, men også på andre ekstracellulære matrix-rige væv, herunder brusk, tæt bindevæv, og dermis.
Enkeltcellet RNA-sekventering er et effektivt værktøj til dechifrering af in vivocellepopulationsstruktur, hierarki, interaktioner og homøostase1,2. Resultaterne afhænger imidlertid stærkt af det første trin i denne avancerede analyse – forberedelsen af en enkeltcellet suspension af perfekt kvalitet ud af det komplekse, velorganiserede væv. Dette omfatter at holde celler i live og forhindre uønskede, kunstige ændringer i genekspression profiler af cellerne3,4. Sådanne ændringer kan føre til en unøjagtig karakteristik af befolkningsstrukturen og fejlfortolkning af de indsamlede data.
Der er udviklet specifikke protokoller for isolering ud af en lang række væv5,6,7,8. De anvender normalt mekanisk dissociation i kombination med yderligere inkubation med forskellige proteolytiske enzymer. Disse omfatter typisk trypsin, kollagen, dispases, papain6,7,8,9, eller kommercielt tilgængelige enzym blandinger såsom Accutase, Tryple, etc.5. Den mest kritiske del, der påvirker transcriptome kvalitet er enzymatisk fordøjelse. Det blev påvist, at langvarig inkubation med enzymer ved 37 °C påvirker genekspressionen og forårsager opregulering af mange stressrelaterede gener10,11,12,13. Den anden kritiske parameter i isolationsprocessen er dens samlede længde, da det er blevet vist, at celletransskriptomer ændrer sig efter vævskæmi14. Denne protokol præsenterer en effektiv protokol for blid isolering af enkelte celler fra mus og menneskelige tænder, hurtigere end andre, tidligere anvendte protokoller til isolering af celler fra komplekse væv5,6,9,11,13,15,16.
Denne protokol præsenterer, hvordan man hurtigt dissekere blødt væv fra den hårde tand og forberede en enkeltcellet suspension egnet til scRNA-seq. Denne metode anvender kun et centrifugeringstrin og minimerer effekten af uønskede transskriptionelle ændringer ved at reducere vævshåndterings- og fordøjelsestiden og holde væv og celler på 4 °C det meste af tiden. Proceduren viser isolering af celler fra mus fortænder, molar, og menneskelig visdom tænder som et eksempel, men primært bør arbejde for andre tænder i forskellige organismer. Den komplette protokol visualiseres skematisk i figur 1. Denne protokol er for nylig blevet brugt til at generere en dental celle type atlas opnået fra mus og menneskelige tænder1.
Studere tænder og knogler på cellulære eller molekylære niveau er generelt udfordrende, da celler danner disse væv er omgivet af forskellige former for hårde matricer19. Et af de vigtigste mål for at udføre encellet RNA-seq på tandvæv er behovet for at få celler af interesse hurtigt og uden kunstige ændringer i deres transskriptomer. For at opnå dette blev der udviklet en meget effektiv protokol, der er egnet til isolering af celler fra mus og menneskelige tandmasser, hvilket giver mulighed for hurtig generering af enkeltcellede suspensioner til alle transskriptomiske applikationer. Dette blev sikret ved hurtig vævsisolering, minimering af trinene i vævs- og cellemanipulationer og strømlining af den mekaniske og enzymatiske fordøjelse.
De mest kritiske trin i denne protokol er hurtig vævsbehandling og tilstrækkelig enkeltcellet suspensionspræparat8,9. En manuel tilgang bruges til at opnå dental papirmasse uden at udnytte en dental boremaskine eller andre varme-genererende enheder. Overophedning kan forårsage et kunstigt udtryk for varmechokproteiner og andre gener, hvilket i sidste ende fører til, at de analyserede genekspressionsmønstre ikke er repræsentative for det oprindelige væv20. Manuel væv høst kan være et udfordrende skridt, der sandsynligvis vil have brug for nogle uddannelse på forhånd. Pulpen skæres derefter i små stykker og fordøjes enzymatisk ved 37 °C. Bortset fra 15-20 min enzymatisk fordøjelse udføres hele protokollen ved 4 °C. Vævsbehandling og især den enzymatiske fordøjelse blev minimeret til den kortest mulige tid, da en mere langvarig inkubation ved 37 °C kan forårsage ændringer i genekspressionsmønstre10. Mekanisk fjernelse af dentin anbefales før enzymatisk fordøjelse. Dentin og pulp-vedhæftet predentin indeholder en stor mængde kollagen, og dens overdrevne tilstedeværelse kan reducere effektiviteten af fordøjeopløsningen. Efter at være blevet fjernet fra kroppen (eller død af organismer), blev det vist, at cellerne begynder at ændre deres genekspression mønstre hurtigt12. Derfor bør celleisolation og behandling udføres så hurtigt som muligt. Den nuværende protokol reducerer behandlingstiden til 35-45 min fra isolering af vævet (aflivning af dyr) til forberedelse af encellet suspension.
En alternativ ændring af denne teknik er cellebevarelse til senere brug. Dette opnås ved methanolfiksering. Metanolfast celleaffjedring kan opbevares i op til 1 måned ved -80 °C som beskrevet i protokollen21. Når det er muligt, skal du dog udføre scRNA-seq direkte, da det blev påvist, at enkeltcelledata fra metanolfaste encellede suspensioner kan lide af øget udtryk for stressrelaterede gener og forurening med omgivende RNA22. Dette trin kan have brug for yderligere ændringer i henhold til producentens protokoller.
Før den første anvendelse af denne protokol anbefales det at udføre flere valideringstrin for at teste teknikken. Det er vores erfaring, at vi tester de førnævnte kritiske trin i protokollen. Derudover foreslår vi at teste effektiviteten af kollagen P-opløsningen og teste håndteringen af vævsdesociationstrinnet. Specifikt, omkring de første 5 minutter efter indledningen af kollagen P inkubation, bør stykker af væv samles sammen. Dette er en fælles situation. Aggregater opløses hver 3-4 minutter ved hjælp af en 1 mL pipette, og med stigende tid, bør de blive mindre, indtil knap synlige.
Desuden anbefales det at udføre celletælling i et celletællingskammer før centrifugering og før og efter filtrering for at opdage mulige celletab på grund af suboptimal supernatant fjernelse. Hvis den endelige enkeltcelleaffjedring skal renses, kan FACS bruges. Cellesortering gør det ikke kun muligt at fjerne snavs eller døde celler, men gør det vigtigt at berige den endelige suspension med fluorescerende mærkede celler13,19. For at undgå forskydningsstress eller tilstopning af cellesortering anvendes en bred dyse (85 μm eller 100 μm). Dette vil yderligere forbedre levedygtigheden af de sorterede celler.
Denne teknik blev designet og testet på både mus og menneskelige tænder. Den vigtigste begrænsende faktor er det lille antal celler i de reducerede tandmasser af tænderne på ældre mus (kindtænder) og mennesker. Antag, at et større antal celler skal opnås, eller celler fra tænderne på ældre patienter skal erhverves. En mulig løsning er at behandle et højere antal tænder og flette dem ind i et enkelt parti, efterfølgende behandles som en prøve.
Levende celler af human dental pulp blev for det første isoleret mere end tyve år siden ved hjælp af en enzym blanding af kollagenase I og dispase23. Siden da blev isolationer af tandmasseceller udbredt, og flere teknikker er blevet brugt5,6,7,8. Den kritiske betydning af den metode, der præsenteres her, er tilpasningen af alle isolationstrin for at gøre isolationen hurtig og skånsom for at sikre den høje kvalitet af den endelige celleaffjedring til scRNA-seq. Højere celleudbytte kan opnås ved mere langvarig inkubation med enzymer. Denne protokol giver en effektiv løsning til hurtigt at få enkelte celler fra mus og menneskelige tænder af passende kvalitet til enkeltcellet RNA-sekventering. Denne teknik forventes at blive meget udbredt til andre væv eller organismer med kun små tekniske ændringer.
The authors have nothing to disclose.
J.K. blev støttet af Grant Agency of Masaryk University (MUNI/H/1615/2018) og af midler fra Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet MU til juniorforsker. J.L. blev støttet af Grant Agency of Masaryk University (MUNI/IGA/1532/2020) og er en Brno Ph.D. Talent Scholarship Holder – Finansieret af Brno City Kommune. T.B. blev støttet af Den Østrigske Videnskabsfond (Lise Meitner tilskud: M2688-B28). Vi takker Lydie Izakovicova Holla og Veronika Kovar Matejova for deres hjælp til at få menneskelige tænder. Endelig takker vi Radek Fedr og Karel Soucek for deres venlige hjælp med FACS sortering.
APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |