Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

Summary

Het huidige protocol presenteert een snelle, efficiënte en zachte methode voor het isoleren van enkele cellen die geschikt zijn voor eencellige RNA-seq-analyse van een continu groeiende muizensnijtand, muizenkies en menselijke tanden.

Abstract

Muis en menselijke tanden vormen uitdagende organen voor snelle en efficiënte celisolatie voor transcriptomische of andere toepassingen met één cel. Het tandpulpweefsel, rijk aan de extracellulaire matrix, vereist een lang en vervelend dissociatieproces dat meestal langer is dan de redelijke tijd voor transcriptomica met één cel. Om kunstmatige veranderingen in genexpressie te voorkomen, moet de tijd die is verstreken vanaf het euthanaseren van een dier tot de analyse van afzonderlijke cellen worden geminimaliseerd. Dit werk presenteert een snel protocol dat het mogelijk maakt om eencellige suspensie te verkrijgen van muizen- en menselijke tanden in een uitstekende kwaliteit die geschikt is voor scRNA-seq (single-cell RNA-sequencing). Dit protocol is gebaseerd op versnelde weefselisolatiestappen, enzymatische spijsvertering en daaropvolgende voorbereiding van de uiteindelijke eencellige suspensie. Dit maakt een snelle en zachte verwerking van weefsels mogelijk en maakt het mogelijk om meer dierlijke of menselijke monsters te gebruiken voor het verkrijgen van celsuspensies met een hoge levensvatbaarheid en minimale transcriptionele veranderingen. Verwacht wordt dat dit protocol onderzoekers kan begeleiden die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van de scRNA-seq, niet alleen op de muis of menselijke tanden, maar ook op andere extracellulaire matrixrijke weefsels, waaronder kraakbeen, dicht bindweefsel en dermis.

Introduction

Single-cell RNA sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het ontcijferen van in vivo celpopulatiestructuur, hiërarchie, interacties en homeostase1,2. De resultaten ervan zijn echter sterk afhankelijk van de eerste stap van deze geavanceerde analyse – de voorbereiding van een eencellige suspensie van perfecte kwaliteit uit het complexe, goed georganiseerde weefsel. Dit omvat het in leven houden van cellen en het voorkomen van ongewenste, kunstmatige veranderingen in genexpressieprofielen van de ^cellen3,4. Dergelijke veranderingen kunnen leiden tot de onnauwkeurige karakterisering van de populatiestructuur en een verkeerde interpretatie van de verzamelde gegevens.

Specifieke protocollen voor de isolatie van een breed scala aan weefsels zijn ontwikkeld5,6,7,8. Ze gebruiken meestal mechanische dissociatie in combinatie met verdere incubatie met verschillende proteolytische enzymen. Deze omvatten meestal trypsine, collagenasen, dispasen, papaïne6,7,8,9, of commercieel verkrijgbare enzymmengsels zoals Accutase, Tryple, ^enz.5. Het meest kritieke onderdeel dat de transcriptoomkwaliteit beïnvloedt, is enzymatische spijsvertering. Er werd aangetoond dat langdurige incubatie met enzymen bij 37 °C de genexpressie beïnvloedt en de opregulatie van veel stressgerelateerde genen veroorzaakt10,11,12,13. De andere kritische parameter van het isolatieproces is de totale lengte, omdat is aangetoond dat celtranscriptomen veranderen na de ^{weefselischemie14}. Dit protocol presenteert een efficiënt protocol voor zachte isolatie van afzonderlijke cellen uit muizen- en menselijke tanden, sneller dan andere, eerder gebruikte protocollen voor het isoleren van cellen uit complexe weefsels5,6,9,11,13,15,16.

Dit protocol presenteert hoe we zacht weefsel snel van de harde tand te ontleden en een eencellige suspensie te bereiden die geschikt is voor scRNA-seq. Deze methode maakt gebruik van slechts één centrifugatiestap en minimaliseert het effect van ongewenste transcriptionele veranderingen door de weefselbehandelings- en verteringstijd te verkorten en het weefsel en de cellen meestal op 4 ° C te houden. De procedure toont de isolatie van cellen van muistanden, kiezen en menselijke verstandskiezen als voorbeeld, maar zou voornamelijk moeten werken voor andere tanden in verschillende organismen. Het volledige protocol is schematisch gevisualiseerd in figuur 1. Dit protocol is onlangs gebruikt om een atlas van het tandceltype te genereren die is verkregen uit muizen- en menselijke ^tanden1.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de internationale en lokale regelgeving en goedgekeurd door het ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport, Tsjechië (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Dit protocol werd getest met zowel mannelijke als vrouwelijke wildtype C57BL/6 en CD-1 muizen en met genetisch gemodificeerde Sox10::iCreERT2 muizen17 (gecombineerd met verschillende reporter systemen) op een C57BL/6 achtergrond. Experimenten met menselijke monsters werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Commissies voor Ethiek van de Medische Faculteit, Masaryk University Brno & St. Anne’s Faculty Hospital in Brno, Tsjechië. 1. Experimentele opzet en voorbereiding van oplossingen Instrument set-up Laat de centrifuge afkoelen tot 4 °C. Verwarm de incubatiekamer tot 37 °C. Start de fluorescentie-geactiveerde celsorteermachine (FACS) en stel alle temperaturen van de sorteerder (inclusief opvangbuishouder) in op 4 °C. Voer de kwaliteitscontrole van het instrument uit, stel de valvertraging in. Stel de voorlopige gatingstrategie in en voer de testsortering uit.OPMERKING: Gebruik bij gebruik van FACS het mondstuk van 100 μm. Bereid de oplossingen voor (stappen 1.2.1-1.2.3). Wasoplossing: Bereid verse 2% FBS (Foetaal Runderserum) in HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution). Digestiemengsel: Bereid vers collagenase P (3 U / ml) volledig opgelost in HBSS. Optioneel: Bereid verse HBSS + BSA (0,04%) en koel methanol van analytische kwaliteit in een vriezer van -20 °C voor het bewaren van eencellige suspensie bij -80 °C.OPMERKING: Stap 1 moet worden uitgevoerd voordat het experiment begint. De samenstelling van de gebruikte oplossingen is samengevat in aanvullende tabel 1. 2. Bereiding van proefdier(en) en menselijke tand(en) Bereid de proefdieren voor (muis). Euthanaseer de muis volgens de lokale voorschriften; bijvoorbeeld door een overdosis anesthetica zoals eerder beschreven1.LET OP: De regelgeving voor humane euthanasie van proefdieren varieert lokaal. Volg altijd de geldende lokale voorschriften. Ga onmiddellijk verder met de weefseldissectiestap (stap 3).OPMERKING: Als het weefsel van de proefdieren niet onmiddellijk kan worden ontleed (bijvoorbeeld vanwege overdracht van de dierenverblijven), plaats de proefdieren dan op ijs en voer zo snel mogelijk weefseldissectie uit. Om meer cellen uit muizenkiezen te verkrijgen, gebruikt u jongere (6 weken en minder) dieren. Met toenemende leeftijd neemt de grootte van tandpulp af. Muis snijtanden behouden meestal hun structuur met toenemende leeftijd, zodat dieren van verschillende leeftijden kunnen worden gebruikt voor weefseldissectie. Bereid de menselijke tand voorOPMERKING: Menselijke tanden werden geëxtraheerd om een klinisch relevante reden. Elke diagnose werd individueel behandeld en een ervaren kaakchirurg voerde altijd de tandextractie uit. Doe de vers geëxtraheerde tand onmiddellijk in een buis van 50 ml met ijskoude HBSS en houd de buis op ijs tot verdere verwerking.OPMERKING: Het gebruik van achtergebleven verstandskiezen van patiënten tot de leeftijd van 25-30 jaar wordt aanbevolen voor de hoogste celopbrengst. 3. Weefseldissectie Houd het proefdier achter zijn kop en kijk naar het ventrale aspect van zijn kop, zodat de staart weg wijst. Verwijder met een kleine, scherpe schaar snel de huid van de onderkaak om de mandibulaire boog, het zachte weefsel tussen elke helft van de kaken en de aangrenzende gezichtsspieren bloot te leggen. Maak een diepe snede van elke kant van de onderkaak; eerst door m. masseter langs de buccale kant van de onderkaak tot aan het temporomandibulaire gewricht, en vervolgens langs het binnenste deel van elke helft van de onderkaak door de basis van de mondholte (zie aanvullende figuur 1). Snijd alle spieren en ligamenten langs de onderkaak tot aan het temporomandibulaire gewricht van zowel buiten als binnen in de mondholte.OPMERKING: Vermijd het snijden van botten. Dit kan het meest apicale deel van de snijtand beschadigen. Pak de onderkaak vast met een gebogen pincet en verwijder deze. Splits vervolgens de ontleedde onderkaak met een schaar in twee helften door mandibulaire symfyse door te snijden (zie aanvullende figuur 1). Gebruik een industrieel laag pluisdoekje om het resterende zachte weefsel uit elke helft van de onderkaak te schuren. Nadat beide delen van de onderkaak zijn gereinigd, plaatst u ze in een vooraf bereid petrischaaltje met ijskoude HBSS.OPMERKING: Werk vanaf dit punt op ijs. Verdere dissectie van muistanden en kiezen wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop met een zwarte achtergrond. Muis mandibulaire snijtanden Verwijder voor de dissectie van mandibulaire snijtanden de alveolaire richel met alle drie de kiezen en scheur de mandibulaire boog transversaal op de plaats die overeenkomt met de positie tussen de eerste en tweede kies.OPMERKING: Een scherp scalpelmes nr. 11 en een pincet worden gebruikt om deze stap uit te voeren (zie Tabel met materialen). Trek voorzichtig de snijtand uit de rest van de tandkom.OPMERKING: Indien succesvol, zal de geëxtraheerde snijtand intacte apicale delen bevatten, inclusief epitheelweefsel met volledige cervicale lussen. Verwijder indien nodig de resterende botfragmenten die nog aan de snijtand zijn bevestigd met een pincet en een scalpel. Plaats de ontleedde snijtanden in verse, ijskoude HBSS en ontleed het weefsel van belang: cervicale lus, tandpulp of andere delen van de tand. Plaats het ontleedde zachte weefsel in een druppel verse, ijskoude HBSS in het midden van een petrischaaltje van 10 cm. Blijf op ijs. Muis mandibulaire kiezen Voor het ontleden van mandibulaire kiezen, verwijder de alveolaire rand volledig van de rest van de onderkaak met behulp van een scalpelmes. Verplaats de ontleedde alveolaire kuif in een verse, ijskoude HBSS in een petrischaaltje en verwijder voorzichtig alle resterende fragmenten van alveolaire botten die aan de wortels zijn bevestigd. Plaats de ontleedde kiezen zonder alveolair bot in een frisse, ijskoude HBSS. Om de pulp bloot te leggen, begint u delen van het dentine van de apicale kant te verwijderen met behulp van een fijn, scherp pincet totdat u de pulpholte bereikt. Zodra de pulpholte is bereikt, ontleedt u zorgvuldig tandpulp met behulp van een pincet met scherpe punt en plaatst u het zachte weefsel van de tandpulp in een druppel verse, ijskoude HBSS in het midden van een petrischaaltje van 10 cm dat op ijs wordt bewaard.OPMERKING: Aangezien muizenkiezen extreem klein zijn, moet u de vergroting op de stereomicroscoop dienovereenkomstig aanpassen. Menselijke tand Was de menselijke tand nogmaals in ijskoude HBSS om het resterende bloed te verwijderen. Plaats de tand in drie dikwandige steriele plastic zakken en gebruik een gietijzeren benchtop engineer’s vise om de tand te kraken. Gebruik vise jaws met een plat oppervlak om te voorkomen dat de zakken binnendringen. Draai de vise langzaam aan totdat je de tand hoort kraken; haal het uit de zakken en plaats het in verse, ijskoude HBSS in een petrischaaltje. Haal met twee pincetten de tandpulp eruit, reinig het van alle resten van hard weefsel en plaats het in één druppel ijskoude HBSS in het midden van een petrischaaltje van 10 cm dat op ijs wordt bewaard.LET OP: Menselijk weefsel kan mogelijk besmettelijk zijn. Gebruik bij het werken met menselijk weefsel beschermende uitrusting om direct contact met het weefsel te voorkomen. 4. Bereiding van eencellige suspensie Bereid een buis van 15 ml met 2,5 ml verteringsmengsel bestaande uit Collagenase P (3 U / ml) volledig opgelost in HBSS. Houd de oplossing op ijs tot gebruik.OPMERKING: Gebruik altijd vers bereid Collagenase P; vries de aliquots niet in. Collagenase P-activiteit varieert van batch tot batch. Controleer de activiteit van uw batch voordat u verdunt. Collagenase P wordt geactiveerd door calcium, waarvan de hoeveelheid al voldoende is in het gelyofiliseerde poeder. Daarom is het niet nodig om de enzymmix te verrijken met calcium. Collagenase P wordt niet geïnactiveerd door FBS, maar kan worden geïnactiveerd door chelaatvormers (bijv. Ethyleendiaminetetraaceticum – EDTA). Het stoppen van het dissociatieproces wordt verzekerd door het verdunnen van de Collagenase P in wash-oplossing (2% FBS in HBSS). Het is aangetoond dat het toevoegen van FBS de levensvatbaarheid van cellen en het uiteindelijke aantal cellen na sortering verhoogt18. Snijd met een rond scalpelmesje nr. 10 het weefsel in alle richtingen in de kleinst mogelijke stukjes. Reaggregateer de weefselstukken in het midden van de druppel en snijd herhaaldelijk de weefselaggregaten met behulp van een rond (nr. 10) scalpelmes. Herhaal dit proces meerdere keren totdat het materiaal voldoende is gehakt. Breng de versnipperde stukjes weefsel met behulp van een pipetpunt van 1 ml over in het bereide digestiemengsel.OPMERKING: In het geval van een groter aantal dieren dat tegelijkertijd wordt verwerkt, splitst u het weefsel in verschillende buizen met Collagenase P. De maximale hoeveelheid per buis zijn pulp verkregen uit ongeveer 10 muistanden. In het geval van kiezen, waar pulp veel kleiner is, kan het aantal verwerkte pulp voldoende worden verhoogd. Gebruik bij het gebruik van menselijke tanden maximaal 2-3 pulp per buis, afhankelijk van de pulpgrootte. Plaats de tube in een voorverwarmde incubator van 37 °C met een shaker. Kantel de buis in de shaker in een hoek van 60° en stel de snelheid in op 150-200 tpm om constante ophangingsbewegingen in de buis te garanderen. Trituraleer de suspensie elke 3-4 minuten krachtig met een pipetpunt van 1 ml om alle klonten te desintegreren.OPMERKING: Na verloop van tijd zullen de klonten kleiner en zachter worden totdat ze bijna verdwijnen. In totaal, incubateer gedurende 15-20 minuten. Triturateer aan het einde van de incubatie voor de laatste keer en voeg vervolgens langzaam ijskoude wasoplossing toe aan een eindvolume van 12 ml. Verwijder de resterende klonten of stukjes verkalkt weefsel door de suspensie te filteren met behulp van een celzeef van 50 μm. Neem 10-20 μL van de gefilterde celsuspensie en tel de cellen tijdens het centrifugeren met behulp van een celtelkamer (Hemocytometer). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een serologische pipet van 10 ml.OPMERKING: Als het aantal cellen beperkt is dat niet kan worden geteld in verdunde suspensie, sla dan het cel tellen over en gebruik alle cellen voor verdere verwerking. Optioneel: Ga verder voor fixatie en opslag21. Suspensie van de pellets (tot 107 cellen) opnieuw in 100 uL HBSS + BSA (0,04%). Voeg 400 μL gekoelde methanol toe en meng langzaam. Incubeer de celsuspensie gedurende 15 minuten op ijs. Bewaren bij -80 °C tot ze verwerkt zijn (niet langer dan 1 maand). Resuspend de pellet in de wasoplossing. Streef naar 700-1200 cellen/μL van de wash-oplossing. Houd de buis op ijs tot verdere verwerking.OPMERKING: Voer indien nodig de fixatie en opslag uit bij -80 °C. Onmiddellijke verwerking van de celsuspensie voor scRNA-seq wordt echter aanbevolen. Verdere stappen zullen afhangen van het eencellige RNA seq-protocol. Wanneer het scRNA-seq-protocol een microfluïdisch systeem gebruikt (sommige sc-RNA-seq-bedrijven doen dat), laadt u de cellen op basis van de richtlijnen van de fabrikant direct of na celsortering. Ga voor FACS verder met stap 5. 5. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Bereid voor het sorteren het celsorteerinstrument voor. Koel het hele systeem af tot 4 °C, voer de kwaliteitscontrole van het instrument uit, stel de valvertraging en de spanning van de afbuigplaten in. Plaats opvangbuizen in de opvangbuishouder.OPMERKING: Om extra centrifugatiestappen te voorkomen die resulteren in een onvermijdelijk celverlies, sorteert u cellen in een microbuis (1,5 ml) met een kleine hoeveelheid (25-50 μL) van de Wash-oplossing. Optioneel: voer levensvatbaarheidskleuring uit vóór FACS. Voeg propidiumjodide toe in celsuspensie vóór FACS tot een eindconcentratie van 0,5 μg/ml en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Laad het monster in de celsorteerder. Stel een strikte gating-strategie in om celresten, doubletten en dode cellen te verwijderen. Sorteer de cellen in een voorbereide buis of multi-well platen. Een voorbeeld van een gatingstrategie is weergegeven in figuur 2.OPMERKING: Om manipulatiestappen te minimaliseren en het protocol te versnellen, wordt het toepassen van een strikte gating-strategie aanbevolen (voorgesteld in figuur 2) in plaats van een levensvatbaarheidskleuring te gebruiken. Om de immuuncellen van de geïsoleerde populatie te scheiden, kan CD45-antilichaamkleuring worden uitgevoerd. Om dit uit te voeren, resuspend celsuspensie in 100 μL kleuringsoplossing (PBS + 2% FBS + anti-CD45-APC geconjugeerd antilichaam 1/100 verdunning). Incubeer gedurende 15 minuten op ijs beschermd tegen licht en voer FACS direct uit.

Representative Results

Voorbeeldige isolatie van afzonderlijke cellen werd uitgevoerd van twee mandibulaire snijtanden van een 6 weken oud C57BL/6 muismannetje. Volgens dit protocol werd een eencellige suspensie voorbereid en vervolgens werd eencellige sequencing uitgevoerd. De geprepareerde eencellige suspensie werd geanalyseerd en gesorteerd met behulp van FACS (figuur 2). Ten eerste werd de FSC-A (forward scatter, area) en SSC-A (side scatter, area) plotting toegepast, en een geschikte gating-strategie werd gebruikt om een populatie te selecteren met verwachte grootte en granulariteit om ons celpuin en celdubbelt of aggregaten te filteren (Figuur 2A). Deze geselecteerde populatie (P1), die 38% van alle gebeurtenissen telde, werd verder gebruikt en FSC-A- en FSC-H-parameters (voorwaartse spreiding, hoogte) werden toegepast om de resterende celdubbeletten te verwijderen (figuur 2B). De populatie zonder celdubbelts (P2) die 95% van P1 tellen, kan vervolgens worden gebruikt voor scRNA-seq. Als alternatief kan extra gating worden gebruikt om de populatie van belang te selecteren (bijv. Expressie van fluorescerende eiwitten of levende / dode kleuring). Om het aantal levende/dode cellen in de eindsuspensie te controleren, werd de PI (propidiumjodide) kleuring uitgevoerd (figuur 2C). De P3-populatie met PI- (levende) cellen was 98,4% van de ouder P2-populatie en 35,5% van de totale gebeurtenissen. Het totale aantal uitgefilterde, dode (PI+) cellen was 1887. Het uiteindelijke aantal cellen verkregen zonder levensvatbaarheidskleuring geschikt voor RNA-seq (P2) telde 118.199 cellen uit twee muistandwielpulpen. Dit betekent het aantal van bijna 60.000 levende cellen van één mandibulaire snijtand. Om het aantal immuuncellen in de uiteindelijke eencellige suspensie te verduidelijken, werden twee benaderingen gebruikt. Ten eerste werden de CD45-antilichaamkleuring en de daaropvolgende FACS-analyse gebruikt. Als aanvullende methode werd het totale aantal immuuncellen (CD45+) in scRNA-seq data geanalyseerd. FACS-analyse toonde 14,44% van de CD45+ cellen (13,20% levend en 1,24% dood) (figuur 3A). Analyse van scRNA-seq-gegevens toonde 10,90% van de CD45-tot expressie brengende cellen (figuur 3B). De afname van CD45+ cellen in scRNA-seq data kan worden veroorzaakt door extra thresholding tijdens scRNA-seq analyse. Deze representatieve gegevens over het voorbeeld van muistand laten zien dat het gegeven protocol in combinatie met een strikte gating-strategie efficiënt is in het verkrijgen van een groot aantal cellen uit een enkele muizentand zonder de noodzaak van extra gebruik van levensvatbaarheidskleuring. De verhouding van immuuncellen (CD45+) was gering (13,2%). Bovendien werd eerder aangetoond dat de immuuncellen essentieel zijn bij het handhaven van tandhomeostase, dus het verwijderen van hen uit scRNA-seq-analyse tijdens de FACS zou in sommige toepassingen contraproductief zijn. Figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Verschillende stappen, waaronder temperatuuromstandigheden en verwachte tijd, worden weergegeven om eencellige suspensie van muizen- en menselijke tanden voor te bereiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Voorbeeld van de gating strategie. FSC-A en SSC-A gating werd gebruikt om de P1-poort te produceren, die de celpopulatie weerspiegelt met de verwachte grootte en granulariteit en het cel- en extracellulaire matrixpuin en de meeste grote gebeurtenissen (A) filtert. Vervolgens werd de P1-populatie uitgezet in FSC-H- en FCS-A-plot, waarbij celdubbeletten (B) werden uitgefilterd. Deze P2-populatie werd vervolgens geanalyseerd op de aanwezigheid van dode cellen door propidiumjodide (C). Het aantal gebeurtenissen/cellen per poort wordt weergegeven in (D). (FSC-A – voorwaartse spreiding, oppervlakte; SSC-A – zijspreiding, gebied; FSC-H – voorwaartse spreiding, hoogte; PI – propidiumjodide). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Kwantificering van de immuuncellen. Kwantificering van de immuuncellen werd uitgevoerd door FACS-analyse van cellen gekleurd met anti-CD45-antilichaam en Live / Dead-analyse met behulp van propidiumjodidekleuring (A). Verdere kwantificering van immuuncellen werd uitgevoerd tijdens scRNA-seq-analyse (B). (CD45-APC – anti-CD45 allophycocyanine geconjugeerd antilichaam; PI – propidiumjodide; t-SNE – t-gedistribueerde stochastische inbedding van de buurman). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende figuur 1: Overzicht van het onderkaakdissectieproces. Stippellijnen illustreren gesuggereerde bezuinigingen. TMJ – temporomandibulair gewricht, m. masseter – musculus masseter. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende tabel 1: De samenstellingen van de in het onderzoek gebruikte oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Het bestuderen van tanden en botten op cellulair of moleculair niveau is over het algemeen een uitdaging, omdat cellen die deze weefsels vormen, worden omringd door verschillende soorten harde ^matrices19. Een van de belangrijkste doelen voor het uitvoeren van eencellige RNA-seq op tandheelkundig weefsel is de noodzaak om snel en zonder kunstmatige veranderingen in hun transcriptomen cellen van belang te verkrijgen. Om dit te bereiken, werd een zeer efficiënt protocol ontwikkeld dat geschikt is voor het isoleren van cellen van muizen- en menselijke tandpulp, dat het mogelijk maakt om snel eencellige suspensies te genereren voor alle transcriptomische toepassingen. Dit werd verzekerd door snelle weefselisolatie, het minimaliseren van de stappen van weefsel- en celmanipulaties en het stroomlijnen van de mechanische en enzymatische spijsvertering.

De meest kritieke stappen van dit protocol zijn snelle weefselverwerking en een adequate eencellige suspensiepreparaat8,9. Een handmatige aanpak wordt gebruikt om tandpulp te verkrijgen zonder gebruik te maken van een tandartsboor of andere warmtegenererende apparaten. Oververhitting kan een kunstmatige expressie van heat shock-eiwitten en andere genen veroorzaken, wat er uiteindelijk toe leidt dat de geanalyseerde genexpressiepatronen niet representatief zijn voor het oorspronkelijke ^weefsel20. Handmatige weefseloogst kan een uitdagende stap zijn die waarschijnlijk vooraf wat training nodig heeft. De pulp wordt vervolgens in kleine stukjes gesneden en enzymatisch verteerd bij 37 °C. Met uitzondering van de 15-20 min enzymatische spijsvertering, wordt het hele protocol uitgevoerd bij 4 °C. De weefselverwerking en vooral de enzymatische spijsvertering werden geminimaliseerd tot de kortst mogelijke tijd, omdat meer langdurige incubatie bij 37 °C veranderingen in genexpressiepatronen kan ^{veroorzaken10}. Mechanische verwijdering van het dentine wordt aanbevolen vóór enzymatische spijsvertering. Dentine en het pulp-gebonden predentine bevatten een grote hoeveelheid collageen en de overmatige aanwezigheid ervan kan de effectiviteit van de verteeroplossing verminderen. Na verwijdering uit het lichaam (of de dood van organismen) werd aangetoond dat cellen hun genexpressiepatronen snel beginnen te ^wijzigen12. Daarom moeten celisolatie en -verwerking zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Het huidige protocol vermindert de verwerkingstijd tot 35-45 minuten van het isoleren van het weefsel (euthanasie van het dier) tot het bereiden van eencellige suspensie.

Een alternatieve modificatie van deze techniek is celconservering voor later gebruik. Dit wordt bereikt door methanolfixatie. Methanol-vaste celsuspensie kan maximaal 1 maand worden bewaard bij -80 °C, zoals beschreven in het ^protocol21. Voer echter, waar mogelijk, scRNA-seq rechtstreeks uit, omdat werd aangetoond dat de eencellige gegevens van methanol-vaste eencellige suspensies kunnen lijden aan verhoogde expressie van stressgerelateerde genen en besmetting met ^{omgevings-RNA22}. Deze stap moet mogelijk extra worden aangepast volgens de protocollen van de fabrikant.

Vóór de eerste toepassing van dit protocol wordt aanbevolen om verschillende validatiestappen uit te voeren om de techniek te testen. Vanuit onze ervaring stellen we voor om de bovengenoemde kritieke stappen van het protocol te testen. Daarnaast stellen we voor om de effectiviteit van de collagenase P-oplossing te testen en de behandeling van de weefseldissociatiestap te testen. Specifiek, rond de eerste 5 minuten na de start van collagenase P incubatie, moeten de stukjes weefsel samen aggregeren. Dit is een veel voorkomende situatie. Aggregaten worden elke 3-4 minuten gedesintegreerd met behulp van een pipet van 1 ml en met toenemende tijd moeten ze kleiner worden totdat ze nauwelijks zichtbaar zijn.

Bovendien wordt aanbevolen om celtellingen uit te voeren in een celtelkamer vóór centrifugeren en voor en na het filteren om mogelijke celverliezen als gevolg van suboptimale verwijdering van supernatanten te detecteren. Als de uiteindelijke eencellige suspensie moet worden gezuiverd, kan FACS worden gebruikt. Celsortering maakt het niet alleen mogelijk om puin of dode cellen te verwijderen, maar maakt het ook mogelijk om de uiteindelijke suspensie te verrijken met fluorescerend gelabelde ^cellen13,19. Om schuifspanning of verstopping van de celsorteerder te voorkomen, wordt een breed mondstuk (85 μm of 100 μm) gebruikt. Dit zal de levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen verder verbeteren.

Deze techniek is ontworpen en getest op zowel muizen- als menselijke tanden. De belangrijkste beperkende factor is het kleine aantal cellen in de verminderde tandpulp van de tanden van oudere muizen (kiezen) en mensen. Stel dat er een groter aantal cellen moet worden verkregen of cellen uit de tanden van oudere patiënten moeten worden verkregen. Een mogelijke oplossing is om een groter aantal tanden te verwerken en samen te voegen tot één batch, vervolgens verwerkt als één monster.

Levende cellen van menselijke tandpulp werden meer dan twintig jaar geleden voor het eerst geïsoleerd met behulp van een enzymmengsel van collagenase I en ^dispase23. Sindsdien werden isolaties van tandpulpcellen op grote schaal gebruikt en zijn verschillende technieken gebruikt5,6,7,8. De kritische betekenis van de hier gepresenteerde methode is de aanpassing van alle isolatiestappen om de isolatie snel en zacht te maken om de hoge kwaliteit van de eindcelsuspensie voor scRNA-seq te garanderen. Een hogere celopbrengst kan worden verkregen door meer langdurige incubatie met enzymen. Dit protocol biedt een efficiënte oplossing voor het snel verkrijgen van afzonderlijke cellen uit muizen- en menselijke tanden van geschikte kwaliteit voor eencellige RNA-sequencing. Deze techniek zal naar verwachting op grote schaal worden gebruikt voor andere weefsels of organismen met slechts kleine technische wijzigingen.

Materials

APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	10735078001
CellTrics 50 µm, sterile	Sysmex	04-004-2327
Collagenase P (COLLP-PRO)	Roche	11213857001
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10	AESCULAP	16600495
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11	AESCULAP	16600509
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin	Biosera	FB-1101/500
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+	SIGMA	H6648
Industrial low lint wipes, MAX60	Dirteeze	MAX60B176
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm	Value-Tec	50-014366
Methyl alcohol A.G.	Penta	21210-11000
Propidium Iodide Solution	BioLegend	421301
Scalpel handle	CM Instrumente	AG-013-10
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs.	CAPP	SP-10-C
Stereo microscope	Leica	EZ4
Surgical scissors (9cm)	CM Instrumente	AI-430-09Y
Tissue culture dish Ø 100 mm	TPP	93100