Snabb isolering av enstaka celler från mus och mänskliga tänder

Summary

Det nuvarande protokollet presenterar en snabb, effektiv och skonsam metod för att isolera enstaka celler lämpliga för encellig RNA-seq analys från en ständigt växande mus framtänd, mus molar och mänskliga tänder.

Abstract

Mus- och människotänder representerar utmanande organ för snabb och effektiv cellisolering för transkriptomiska encelliga eller andra tillämpningar. Tandmassa vävnad, rik på extracellulär matrisen, kräver en lång och tråkig dissociation process som vanligtvis är utöver den rimliga tiden för encelliga transkriptomik. För att undvika artificiella förändringar i genuttrycket gick det den tid som förflutit från att avliva ett djur tills analysen av enstaka celler måste minimeras. Detta arbete presenterar ett snabbt protokoll som gör det möjligt att erhålla encellsfjädring från mus och mänskliga tänder i en utmärkt kvalitet lämplig för scRNA-seq (encellig RNA-sekvensering). Detta protokoll är baserat på accelererade vävnad isolering steg, enzymatiska matsmältning och efterföljande beredning av slutliga encelliga suspension. Detta möjliggör snabb och skonsam bearbetning av vävnader och gör det möjligt att använda fler djur- eller humanprover för att erhålla cellupphängningar med hög livskraft och minimala transkriptionsförändringar. Det förväntas att detta protokoll kan vägleda forskare som är intresserade av att utföra scRNA-seq inte bara på musen eller mänskliga tänder utan också på andra extracellulära matrisrika vävnader, inklusive brosk, tät bindväv och dermis.

Introduction

Encellig RNA-sekvensering är ett kraftfullt verktyg för dechiffrering av in vivo-cellpopulationsstruktur, hierarki, interaktioner och homeostas1,2. Resultaten beror dock starkt på det första steget i denna avancerade analys – beredningen av en encellsfjädring av perfekt kvalitet ur den komplexa, välorganiserade vävnaden. Detta omfattar att hålla cellerna vid liv och förhindra oönskade, artificiella förändringar i cellernas genuttrycksprofiler3,4. Sådana förändringar kan leda till felaktig karakterisering av befolkningsstrukturen och feltolkning av insamlade data.

Specifika protokoll för isolering av ett brett spektrum av vävnader har utvecklats5,6,7,8. De använder vanligtvis mekanisk dissociation i kombination med ytterligare inkubation med olika proteolytiska enzymer. Dessa inkluderar vanligtvis trypsin, kollagenaser, dispases, papain6,7,8,9, eller kommersiellt tillgängliga enzymblandningar som Accutase, Tryple, ^etc.5. Den mest kritiska delen som påverkar transkriptomkvaliteten är enzymatisk matsmältning. Det visade sig att långvarig inkubation med enzymer vid 37 °C påverkar genuttrycket och orsakar uppreglering av många stressrelaterade gener10,11,12,13. Den andra kritiska parametern i isoleringsprocessen är dess totala längd, eftersom det har visat sig att cell transkriptomer förändras efter vävnaden ^ischemi14. Detta protokoll presenterar ett effektivt protokoll för skonsam isolering av enstaka celler från mus och mänskliga tänder, snabbare än andra, tidigare använda protokoll för isolering av celler från komplexa vävnader5,6,9,11,13,15,16.

Detta protokoll presenterar hur man snabbt dissekerar mjukvävnad från den hårda tanden och förbereder en encellig suspension lämplig för scRNA-seq. Denna metod använder endast ett centrifugeringssteg och minimerar effekten av oönskade transkriptionsförändringar genom att minska vävnadshanteringen och matsmältningstiden och hålla vävnaden och cellerna vid 4 °C för det mesta. Förfarandet visar isolering av celler från musständer, molar och mänskliga visdomständer som ett exempel, men bör främst fungera för andra tänder i olika organismer. Det fullständiga protokollet visualiseras schematiskt i figur 1. Detta protokoll har nyligen använts för att generera en dental cell typ atlas som erhållits från mus och mänskliga ^tänder1.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med internationella och lokala bestämmelser och godkändes av Tjeckiens ministerium för utbildning, ungdom och idrott (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Detta protokoll testades med både manliga och kvinnliga vilda typ C57BL/6 och CD-1 möss och med genetiskt modifierade Sox10::iCreERT2 möss17 (kombinerat med olika reportersystem) på en C57BL/6 bakgrund. Experiment med mänskliga prover utfördes med godkännande av kommittén för etik vid den medicinska fakulteten, Masaryk University Brno & St. Anne’s Faculty Hospital i Brno, Tjeckien. 1. Experimentellt inrättande och utarbetande av lösningar Upplägg för instrument Kyl ner centrifugen till 4 °C. Värm inkubationskammaren till 37 °C. Starta den fluorescensaktiverade cellsorteringsmaskinen (FACS) och ställ in alla temperaturer för sorteraren (inklusive uppsamlingsrörshållaren) till 4 °C. Utför instrumentets kvalitetskontroll, ställ in droppfördröjningen. Ställ in den preliminära gatingstrategin och utför testsortering.OBS: Använd munstycket på 100 μm när du använder FACS. Förbered lösningarna (steg 1.2.1-1.2.3). Tvättlösning: Förbered färskt 2% FBS (Fetal Bovine Serum) i HBSS (Hanks balanserade saltlösning). Matsmältningsblandning: Förbered färskt kollagenas P (3 U/ml) helt upplöst i HBSS. Tillval: Förbered färsk HBSS + BSA (0,04%) och kylanalysklass metanol i en frys med -20 °C för förvaring av encellsfjädring vid -80 °C.STEG 1 måste utföras innan experimentet påbörjas. Sammansättningen av de använda lösningarna sammanfattas i tilläggstabell 1. 2. Beredning av försöksdjur och människotand Förbered försöksdjuren (musen). Avliva musen enligt de lokala reglerna; t.ex. överdosering av bedövningsmedel enligt beskrivningen tidigare1.VARNING: Reglerna för human avlivningen av försöksdjur varierar lokalt. Följ alltid gällande lokala bestämmelser. Fortsätt omedelbart till vävnadsfördissekeringssteget (steg 3).OBS: Om vävnaden från försöksdjuren inte kan dissekeras omedelbart (t.ex. på grund av överföring från djurhållningsanläggningen), placera försöksdjuren på is och utför vävnadsavsekering så snart som möjligt. För att få fler celler från mus molarmassa, använd yngre (6 veckor och mindre) djur. Med ökande ålder minskar storleken på tandmassan. Mussnedställningar håller mestadels sin struktur med ökande ålder så att djur i olika åldrar kan användas för vävnadsdissekering. Förbered den mänskliga tandenOBS: Mänskliga tänder extraherades av en kliniskt relevant anledning. Varje diagnos behandlades individuellt, och en erfaren tandläkare kirurg utförde alltid tand extraktion. Lägg den nyutvunna tanden omedelbart i ett 50 ml-rör med iskall HBSS och håll röret på is tills vidare bearbetning.OBS: Användning av kvarhållna visdomständer från patienter fram till 25-30 års ålder rekommenderas för högsta cellutbyte. 3. Vävnadsdesektion Håll det experimentella djuret bakom huvudet och titta på den ventrala aspekten av huvudet så att svansen pekar bort. Använd små, skarpa saxar, ta snabbt bort huden från underkäken för att exponera mandibularbågen, mjukvävnaden mellan varje halva av mandiblesna och de intilliggande ansiktsmusklerna. Gör ett djupt snitt från varje sida av underkäken; först genom m. masseter längs den buccal sidan av underkäken upp till temporomandibular gemensamma, och sedan längs den inre delen av varje halva av underkäken genom basen av munhålan (se kompletterande figur 1). Skär alla muskler och ligament längs underkäken upp till temporomandibular gemensamma från både utsidan och insidan av munhålan.OBS: Undvik att skära ben. Detta kan skada den mest apikala delen av framtänden. Ta tag i underkäken med böjda spetstwecett och ta bort den. Dela sedan upp den dissekerade underkäken i två halvor med sax genom att skära igenom mandibulär symphysis (se kompletterande figur 1). Använd en industriell våtservett för att skava den återstående mjukvävnaden från varje halva av underkäken. När båda delarna av underkäken har rengjorts, placera dem i en förberedd Petri-maträtt med iskall HBSS.OBS: Från och med nu, arbeta på is. Ytterligare dissekering av mussnedställningar och molarer utförs under ett stereomikroskop med svart bakgrund. Musmandibular framtänder För dissekering av mandibular snedställningar, ta bort alveolar åsen med alla tre molarer och transversally knäcka mandibularbågen på den plats som motsvarar positionen mellan den första och andra molaren.OBS: Ett vasst skalpellblad nr 11 och pincett används för att utföra detta steg (se Materialtabell). Dra försiktigt ut snedsatsen ur resten av tandhålan.OBS: Om det lyckas kommer den extraherade framtänden att innehålla intakta apikala delar, inklusive epitelial vävnad med kompletta livmoderhalscancer slingor. Om det behövs, ta bort de återstående benfragmenten som fortfarande är fästa vid snedställningarna med pincett och en skalpell. Placera de dissekerade snedställningarna i färska, iskalla HBSS och dissekera den vävnad som är av intresse: livmoderhalsslinga, tandmassa eller andra delar av tanden. Placera den dissekerade mjukvävnaden i en droppe färsk, iskall HBSS mitt i en 10 cm Petriskål. Håll dig på is. Mus mandibular molarer För dissekering av mandibular molars, ta helt bort alveolar åsen från resten av underkäken med hjälp av ett skalpellblad. Flytta den dissekerade alveolar-krönet till färsk, iskall HBSS i en Petri-skål och ta försiktigt bort alla återstående fragment av alveolarben som är fästa vid rötterna. Placera de dissekerade molarerna utan alveolarben i färska, iskalla HBSS. För att exponera massan, börja ta bort delar av dentin från den apikala sidan med fina, skarpa spets pincett tills du når massahålan. När massahålan har nåtts, dissekera försiktigt tandmassa med ett par vassa spets pincett och placera tandmassans mjuka vävnad i en droppe färsk, iskall HBSS i mitten av en 10 cm Petriskål som hålls på is.OBS: Eftersom mus molar massa är extremt små, anpassa förstoringen på stereomicroscope i enlighet därmed. Mänsklig tand Tvätta människotand igen i iskall HBSS för att ta bort återstående blod. Placera tanden i tre tjockväggiga sterila plastpåsar och använd en bänkskiva i gjutjärn för att knäcka tanden. Använd vise käkar med en plan yta för att undvika att tränga in påsarna. Dra långsamt åt vise tills du hör tanden spricka; ta bort den från påsarna och lägg den i färsk, iskall HBSS i en Petri-skål. Använd två pincett, ta ut tandmassan, rengör den från alla rester av hårdvävnad och placera den i en droppe iskall HBSS i mitten av en 10 cm Petriskål som hålls på is.VARNING: Mänsklig vävnad kan potentiellt vara smittsam. När du arbetar med mänsklig vävnad, använd skyddsutrustning för att undvika direktkontakt med vävnaden. 4. Beredning av encellsfjädring Förbered ett 15 ml rör med 2,5 ml matsmältningsblandning bestående av Collagenase P (3 U/ml) helt upplöst i HBSS. Förvara lösningen på is tills den används.OBS: Använd alltid nyberedd Kollagenas P; frys inte alikvoterna. Collagenase P-aktiviteten varierar från parti till parti. Kontrollera aktiviteten i din sats innan du späder ut den. Kollagenas P aktiveras av kalcium, vars mängd redan är tillräcklig i det frystorkade pulvret. Därför är det onödigt att berika enzymblandningen med kalcium. Kollagenas P inaktiveras inte av FBS men kan inaktiveras av kelaterande medel (t.ex. Etylendiamintetraacetic – EDTA). Att stoppa dissociationsprocessen säkerställs genom utspädning av Collagenase P i tvättlösning (2% FBS i HBSS). Det har visat sig att tillägg av FBS ökar cellens livskraft och det slutliga antalet celler efter sortering18. Skär vävnaden i alla riktningar med hjälp av ett rundformat skalpellblad nr 10. Aggregera vävnadsbitarna i mitten av droppen och skär upprepade gånger vävnadsaggregaten med hjälp av ett rundformat (nr 10) skalpellblad. Upprepa denna process flera gånger tills materialet är tillräckligt malet. Överför de strimlade vävnadsbitarna med en 1 ml pipettspets till den beredda matsmältningsblandningen.OBS: Om ett större antal djur bearbetas samtidigt, dela upp vävnaden i flera rör med Collagenase P. Den maximala mängden per rör är massa som erhålls från cirka 10 musständer. När det gäller molarer, där massa är mycket mindre, kan antalet bearbetade massa ökas tillräckligt. När du använder mänskliga tänder, använd högst 2-3 massa per rör, beroende på massastorleken. Placera röret i en 37 °C förvärmd inkubator med en shaker. Luta röret inuti skakapparaten till en vinkel på 60° och ställ in hastigheten på 150-200 rpm för att säkerställa konstanta fjädringsrörelser inuti röret. Riv kraftigt upphängningen var 3-4 min med en 1 ml pipettspets för att desintegrera alla klumpar.OBS: Med tiden blir klumparna mindre och mjukare tills de nästan försvinner. Totalt inkubera i 15-20 min. I slutet av inkubationen, triturera för sista gången och tillsätt sedan långsamt iskall Tvättlösning till en slutlig volym på 12 ml. Ta bort de återstående klumpar eller bitar av förkalkad vävnad genom att filtrera suspensionen med en 50 μm cellsil. Ta 10-20 μL av den filtrerade cellfjädringen och räkna cellerna under centrifugeringen med hjälp av en cellräkningskammare (Hemocytometer). Centrifugera i 5 min vid 300 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten med en serologisk pipett på 10 ml.OBS: Om antalet celler är begränsat som inte kan räknas i utspädd suspension hoppar du över cellräkningen och använder alla celler för vidare bearbetning. Valfritt: Fortsätt för fixering och lagring21. Suspendera pelletsen (upp till 107 celler) i 100 uL HBSS + BSA (0,04%). Tillsätt 400 μL kyld metanol och blanda långsamt. Inkubera cellfjädringen i 15 minuter på is. Förvara vid -80 °C tills den har bearbetats (högst 1 månad). Återanvänd pelleten i tvättlösningen. Sikta på 700-1200 celler/μL av tvättlösningen. Håll röret på is tills vidare bearbetning.OBS: Utför vid behov fixering och lagring vid -80 °C. Omedelbar behandling av cellavstängningen för scRNA-seq rekommenderas dock. Ytterligare steg kommer att bero på encells RNA seq-protokollet. När scRNA-seq-protokollet använder ett mikrofluidiskt system (vissa sc-RNA-seq-företag gör det), ladda cellerna baserat på tillverkarens riktlinjer antingen direkt eller efter cellsortering. För FACS, fortsätt till steg 5. 5. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) Förbered cellsorteringsinstrumentet innan du sorterar. Kyl ner hela systemet till 4 °C, utför instrumentets kvalitetskontroll, ställ in fallfördröjningen och spänningen på avböjningsplattorna. Lägg uppsamlingsrör i uppsamlingsrörets hållare.OBS: För att undvika ytterligare centrifugeringssteg som resulterar i en oundviklig cellförlust, sortera celler i ett mikrorör (1,5 ml) med en liten mängd (25-50 μL) av tvättlösningen. Valfritt: utför viabilitetsfärgning före FACS. Tillsätt propidiumjodid i cellfjädring före FACS till en slutlig koncentration på 0,5 μg/ml och inkubera i 15 min vid 4 °C. Läs in provet i cellsorteraren. Ställ in en strikt gating-strategi för att ta bort cellrester, dubbletter och döda celler. Sortera cellerna i ett förberett rör eller flerbrunnplattor. Ett exempel på en gatingstrategi visas i figur 2.OBS: För att minimera manipuleringssteg och påskynda protokollet rekommenderas tillämpning av en strikt gating-strategi (föreslås i figur 2) i stället för att använda en bärkraftsfärgning. För att separera immuncellerna från den isolerade populationen kan CD45 antikroppsfärgning utföras. För att utföra detta, återanvänd cell suspension i 100 μL färgning lösning (PBS + 2% FBS + anti-CD45-APC konjugerad antikropp 1/100 utspädning). Inkubera i 15 minuter på is skyddad mot ljus och utför FACS direkt.

Representative Results

Exemplarisk isolering av enstaka celler utfördes från två mandibular framtänder från en 6-veckor gammal C57BL/6 mus hane. Efter detta protokoll förbereddes en encellig suspension, och därefter utfördes encellssekvensering. Den beredda encelliga suspensionen analyserades och sorterades med hjälp av FACS (figur 2). För det första tillämpades FSC-A (framåt spridning, område) och SSC-A (sidospridning, område) plottning, och en lämplig gating strategi användes för att välja en population med förväntad storlek och granularitet för att filtrera våra cell skräp och celldubbel eller aggregat (figur 2A). Denna valda population (P1), som räknade 38% av alla händelser, användes vidare, och FSC-A och FSC-H (framåt spridning, höjd) parametrar tillämpades för att ta bort de återstående celldubbel (figur 2B). Populationen utan celldubbel (P2) som räknar 95% av P1 kan därefter användas för scRNA-seq. Alternativt kan ytterligare gating användas för att välja den intressepopulation (t.ex. uttryck av fluorescerande proteiner eller levande/död färgning). För att kontrollera antalet levande/döda celler i den slutliga suspensionen utfördes PI-färgningen (propidiumjodid) (figur 2C). P3-populationen som innehöll PI- (levande) celler var 98,4% av den överordnade P2-befolkningen och 35,5% av de totala händelserna. Det totala antalet filtrerade, döda (PI+) celler var 1887. Det slutliga antalet celler som erhållits utan livskraft färgning lämplig för RNA-seq (P2) räknade 118,199 celler från två mus framtänder massa. Det innebär att nästan 60 000 levande celler från en mandibulär framtänder. För att klargöra antalet immunceller i den slutliga encelliga suspensionen användes två metoder. För det första användes CD45 antikropp färgning och efterföljande FACS analys. Som en kompletterande metod analyserades det totala antalet immunceller (CD45+) i scRNA-seq-data. FACS-analysen visade 14,44% av CD45+ celler (13,20% levande och 1,24% döda) (figur 3A). Analys av scRNA-seq data visade 10,90% av CD45-expresserande celler (figur 3B). Minskningen av CD45+ celler i scRNA-seq data kan orsakas av ytterligare tröskeltröskel under scRNA-seq analys. Dessa representativa data om exemplet med mus framtänd visar att det givna protokollet i kombination med strikt gating strategi är effektivt för att erhålla ett stort antal celler ur en enda mus tand utan att behöva ytterligare användning av livskraft färgning. Förhållandet mellan immunceller (CD45+) var mindre (13,2%). Dessutom visades det tidigare att immuncellerna är viktiga för att upprätthålla tandhomeostas, så att ta bort dem från scRNA-seq-analys under FACS skulle vara kontraproduktivt i vissa applikationer. Bild 1: Schematisk representation av protokollet. Olika steg, inklusive temperaturförhållanden och förväntad tid, representeras för att förbereda encellsfjädring från mus och mänskliga tänder. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 2: Exempel på gatingstrategin. FSC-A och SSC-A gating användes för att producera P1-porten, vilket återspeglar cellpopulationen med förväntad storlek och granularitet och filtrerade bort cellen och extracellulära matrisskräp och de flesta stora händelser (A). Därefter ritades P1-populationen i FSC-H och FCS-A-tomten, som filtrerade bort celldubbel (B). Denna P2 population analyserades sedan för förekomsten av döda celler av propidium jodid (C). Antalet händelser/celler per port representeras i (D). (FSC-A – framåt spridning, område; SSC-A – sidospridning, område; FSC-H – framåt spridning, höjd; PI – propidiumjodid). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3: Kvantifiering av immuncellerna. Kvantifiering av immuncellerna utfördes genom FACS-analys av celler färgade med anti-CD45-antikroppar och Live/Dead-analys med propidiumjodidfärgning (A). Ytterligare kvantifiering av immunceller utfördes under scRNA-seq analys (B). (CD45-APC – anti-CD45 allophycocyanin konjugerad antikropp; PI – propidiumjodid; t-SNE – t-distribuerad stokastisk granne inbäddning). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Kompletterande figur 1: Översikt över den underkäglade dissekeringsprocessen. Streckade linjer illustrerar föreslagna snitt. TMJ – temporomandibular gemensamma, m. masseter – musculus masseter. Klicka här för att ladda ner den här filen. Tilläggstabell 1: Sammansättningarna av de lösningar som används i studien. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Att studera tänder och ben på cellulär eller molekylär nivå är i allmänhet utmanande eftersom celler som bildar dessa vävnader är omgivna av olika typer av hårda ^matriser19. Ett av huvudmålen för att utföra encelliga RNA-seq på tandvävnad är behovet av att få celler av intresse snabbt och utan några konstgjorda förändringar i deras transkriptomer. För att uppnå detta utvecklades ett mycket effektivt protokoll som är lämpligt för att isolera celler från mus- och humant tandmassa, vilket möjliggör snabb generering av encelliga suspensioner för alla transkriptomiska applikationer. Detta säkerställdes genom snabb vävnad isolering, minimera stegen av vävnad och cell manipuleringar och effektivisera den mekaniska och enzymatiska matsmältningen.

De mest kritiska stegen i detta protokoll är snabb vävnadsbehandling och adekvat encellig suspensionspreparat8,9. Ett manuellt tillvägagångssätt används för att erhålla tandmassa utan att använda en tandborr eller andra värmegenererande enheter. Överhettning kan orsaka ett artificiellt uttryck av värmechockproteiner och andra gener, vilket i slutändan leder till att de analyserade genuttrycksmönstren inte är representativa för den ursprungliga ^vävnaden20. Manuell vävnadsskörd kan vara ett utmanande steg som sannolikt kommer att behöva lite träning i förväg. Massan skärs sedan i små bitar och smälter enzymatiskt vid 37 °C. Med undantag för 15-20 min av enzymatisk matsmältning utförs hela protokollet vid 4 °C. Vävnadsbehandlingen och särskilt den enzymatiska matsmältningen minimerades till kortast möjliga tid eftersom mer långvarig inkubation vid 37 °C kan orsaka förändringar i genuttrycksmönster10. Mekaniskt avlägsnande av dentin rekommenderas före enzymatisk matsmältning. Dentin och massa-fäst predentin innehåller en stor mängd kollagen, och dess överdrivna närvaro kan minska effektiviteten av rötlösningen. Efter att ha avlägsnats från kroppen (eller död av organismer) visade det sig att celler börjar ändra sina genuttrycksmönster ^snabbt12. Därför bör cellisolering och cellbehandling utföras så snabbt som möjligt. Det nuvarande protokollet minskar bearbetningstiden till 35-45 min från att isolera vävnaden (avlivande djur) till att förbereda encellsavstängning.

En alternativ modifiering av denna teknik är cell bevarande för senare användning. Detta uppnås genom metanol fixering. Metanol-fast cell suspension kan lagras i upp till 1 månad vid -80 °C, enligt beskrivningen i ^{protokollet21}. Men när det är möjligt, utför scRNA-seq direkt, eftersom det visades att encelliga data från metanol-fasta encelliga suspensioner kan drabbas av ökat uttryck av stressrelaterade gener och förorening med omgivande ^RNA22. Det här steget kan behöva ändras ytterligare enligt tillverkarens protokoll.

Innan den första tillämpningen av det här protokollet rekommenderas att du utför flera valideringssteg för att testa tekniken. Från vår erfarenhet föreslår vi att du testar de ovannämnda kritiska stegen i protokollet. Dessutom föreslår vi att du testar effektiviteten av collagenase P-lösningen och testar hanteringen av vävnads dissociation steg. Specifikt, runt de första 5 minuterna efter initieringen av kollagenas P inkubation, bör vävnadsbitarna aggregeras tillsammans. Detta är en vanlig situation. Aggregaten sönderdelas var 3-4 min med en 1 ml-pipett, och med ökande tid bör de bli mindre tills de knappt syns.

Dessutom rekommenderas att utföra cellräkning i en cellräkningskammare före centrifugering och före och efter filtrering för att upptäcka eventuella cellförluster på grund av suboptimalt avlägsnande av supernatant. Om den slutliga encellsfjädringen behöver renas kan FACS användas. Cellsortering gör det inte bara möjligt att ta bort skräp eller döda celler utan gör det viktigt att berika den slutliga suspensionen med fluorescerande märkta ^celler13,19. För att undvika skjuvspänning eller igensättning av cellsorteraren används ett brett munstycke (85 μm eller 100 μm). Detta kommer att ytterligare förbättra livskraften hos de sorterade cellerna.

Denna teknik utformades och testades på både mus och mänskliga tänder. Den viktigaste begränsande faktorn är det lilla antalet celler i de minskade tandmassan hos tänderna hos äldre möss (molarer) och människor. Anta att ett större antal celler behöver erhållas eller att celler från tänderna hos äldre patienter ska förvärvas. En möjlig lösning är att bearbeta ett högre antal tänder och slå samman dem i en enda sats, därefter bearbetad som ett prov.

Levande celler av mänsklig tandmassa isolerades först för mer än tjugo år sedan med hjälp av en enzymblandning av kollagenas I och ^dispase23. Sedan dess har isolering av tandmassaceller använts i stor utsträckning, och flera tekniker har använts5,6,7,8. Den kritiska betydelsen av metoden som presenteras här är anpassningen av alla isoleringssteg för att göra isoleringen snabb och skonsam för att säkerställa den höga kvaliteten på den slutliga cellfjädringen för scRNA-seq. Högre cellutbyte kan erhållas genom mer långvarig inkubation med enzymer. Detta protokoll ger en effektiv lösning för att snabbt erhålla enstaka celler från mus och mänskliga tänder av lämplig kvalitet för encellig RNA-sekvensering. Denna teknik förväntas användas i stor utsträckning för andra vävnader eller organismer med endast små tekniska modifieringar.

Materials

APC anti-mouse CD45 Antibody	BioLegend	103112
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	10735078001
CellTrics 50 µm, sterile	Sysmex	04-004-2327
Collagenase P (COLLP-PRO)	Roche	11213857001
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10	AESCULAP	16600495
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11	AESCULAP	16600509
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin	Biosera	FB-1101/500
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+	SIGMA	H6648
Industrial low lint wipes, MAX60	Dirteeze	MAX60B176
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm	Value-Tec	50-014366
Methyl alcohol A.G.	Penta	21210-11000
Propidium Iodide Solution	BioLegend	421301
Scalpel handle	CM Instrumente	AG-013-10
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs.	CAPP	SP-10-C
Stereo microscope	Leica	EZ4
Surgical scissors (9cm)	CM Instrumente	AI-430-09Y
Tissue culture dish Ø 100 mm	TPP	93100