極度切除は、深い定量的プロテオーム分析のために、マウス脳内で最大の神経原性ニッチの新鮮な凍結製剤を可能にする。この方法は正確で効率的であり、最小限の組織摂動を引き起こす。そのため、このニッチの分子微小環境や、他の臓器、領域、種の研究に最適です。
脳下神経原性ニッチは、側心室の側心室壁の寄室リボンから成る。皮下領域(SEZ)は、心室および脳脊髄液にさらされる薄く、明確な領域である。このニッチの分離は、神経性幹細胞微小環境の分析を可能にする。しかし、プロテオーム分析のための小組織の抽出は、特にかなりの測定深さの維持と信頼性の高い堅牢性の達成のために、困難です。これらの課題に対処するために、高精度と組織摂動を最小限に抑えた新しい方法「クライオセクション解剖(CSD)」が開発されました。この方法は、低い豊富なニッチレギュレータの検出を可能にする最先端の質量分析(MS)法と互換性があります。本研究では、CSDとそのプロテオームデータを、レーザー・キャプチャー・マイクロ解剖(LCM)および標準の全マウント解剖によって得られた方法およびデータと比較した。CSD法は、LCMと比較して半分以下の調製時間で定量深度を2倍にし、同時に全マウント解剖の解剖精度を明確に上回った。したがって、CSDはプロテオーム解析のためのSEZを収集するための優れた方法です。
脳神経の神経新生は成人の脳で制限されているように, 様々 な中枢神経系の修復戦略は、大人の神経置換の基盤の理解の増加から大いに利益を得る.げっ歯類は、出生後神経新生の基本的なメカニズムを理解するのに役立ちましたが、成体の神経新生は種に大きく依存しています。マウスには、3つの成体神経幹細胞(NSC)ニッチがある。視床下部は神経因性の可能性を有する成人NSCニッチである1,2、連続成人神経新生は主に海馬3および側心室の側壁のSEZに制限される4,5,6。SEZは、トランジット増幅前駆細胞(C型細胞)を介して神経芽細胞(タイプA細胞)に発展するNSC(B型細胞)を含む最大の胚芽領域です。SEZは、B型細胞の20〜35%、C型細胞の1〜15%、A型細胞の1〜30%、および名誉細胞7の25〜50%を含む。SEZは、内皮細胞、ミクログリア細胞、および幹細胞niche8,9,10に存在し、幹細胞に影響を与える素因性細胞を有する複雑なマイクロアーキテクチャを特徴としている。SEZではニューロンが不足していますが、線条体、腹側のテグメンタル領域、視床下部などの遠くの源から発せられる軸索はB型細胞4に到達し、影響を与えます。この幹細胞ニッチのユニークな特徴は、増殖部位と分化部位との分離である。増殖後、ニューロン前駆物質はSEZから嗅球に数ミリメートル移動し、そこで最終的にニューロンに分化し、既存の神経回路に統合する。神経新生に関連する細胞組み込みプログラムの調査は、実験的治療細胞リプログラミングおよび移植戦略に重要な知識を既に提供しています15,16,17,18,19,20。しかし、細胞外因性シグナルも神経新生を調節し、組織環境は幹細胞11、12、14、21、22、23の神経因性の運命を決定することができる。その結果、神経起源ニッチの微小環境の調査と幹細胞との相互作用が極めて重要である。
細胞外マトリックス(ECM)および他の分泌タンパク質は、微小環境の大部分を占めています。正確な同定と定量を行うために、ECM24,25のトランスクリプトームとタンパク質レベルの相関が低いためにECM組成を決定するトランスクリプソミックアプローチよりもプロテオミクスアプローチが適しています。さらに、SEZのニッチレギュレータは、ニッチ自体を含む細胞によって独占的に産生されないという実質的な証拠があります。脈絡叢のようなより遠い場所では、髄液22,23を介して幹細胞に伝達される変調信号を分泌する。ニッチプロテオームを調査することは、細胞外微小環境のかなりの割合がタンパク質によって組み立てられることを考えると、生産部位とは無関係にニッチに存在するニッチな調節因子を同定するのに役立ちます。
不偏プロテオーム解析のためにマウス室領域を収集するために、高精度の方法が必要であり、隣接する線条体の組織を除いた状態で幹細胞を含むca.50μmの細いパラベンタキュラーリボンを捕捉する。さらに、成長因子やサイトカインを含む可溶性タンパク質を容易に洗い流すことができるため、解剖中の組織摂動を細胞外微小環境解析のために最小限に抑える必要があります。固定組織の質量スペクトルを分析することは可能であるが、パラホルムアルデヒドなどの必要な薬剤は、タンパク質同定深度を低下させ、翻訳後修飾を導入する可能性がある。一般的な全山SEZ解剖、例えば、蛍光活性化細胞選別分析のための細胞の収集のために、はさみ26でSEZ全体を除去する。この標準的な解剖は最低のティッシュの摂動と速い。しかし、サンプルの線条体汚染は避けられません。逆に、LCMは優れた解剖精度の顕著な利点を有する。しかし、LCMは、例えば、バックグラウンド染色またはレーザーによるタンパク質変性のために、組織摂動を導入する可能性があります。全山解離とLCMの強みを組み合わせ、MSと互換性のある新しい方法である、いわゆるクライオセクション解離(CSD)が開発された(図1A-D)。CSDは、SEZの抽出と、SEZの理想的な非神経原性制御領域である側心室(MEZ)の内側壁のSEZの解剖を可能にする(プロトコルを参照)。CSDと最先端のMS法の組み合わせによって得られたニッチプロテオームは、この成人NSC niche25における新規調節因子の特性評価および同定に有用であることが判明した。したがって、この方法は、SEZ組織タンパク質組成物の決定に有用であろう。
CSD法により、SEZ組織を正確に抽出し、MS.CSDを用いて有意な深度の信頼できるプロテオームを生成することが可能となり、SEZサンプルのストリアタル汚染および細胞外タンパク質濃縮の点で、全山解離に比べて明らかな利点を示しています。CSDおよび全マウント解剖を用いて、個々のサンプル(サンプルあたり約6,500個のタンパク質)で同様の数のタンパク質を検出することもできるので、CSDの追加時間は努力する価値があります。LCMは、より正確なSEZ解剖を提供しますが、CSDと同じMSプロトコル(ライブラリマッチングおよびラベルフリー定量)を使用しているにもかかわらず、サンプルあたりわずか3,500個のタンパク質で、より低いプロテオーム深さに達しました。重要なことに、おそらくサンプル当たりの準備時間が8倍長いため、変動性ははるかに大きかった。LCMとCSDによって得られたサンプルのPCAは互いに強く分離された堅い領域特異的なクラスターとの両方の方法の明確な分離を明らかにする。対照的に、LCMサンプルはより分散した分布を示しており、これはおそらく準備の長さによるものであった。より長い期間にわたってはるかに多くのサンプルを収集することが、LCMと同等の堅牢性と深さのプロテオームをもたらしたかどうかは不明です。推定値を計算すると、CSDに対して行われた同様のサンプル量を収集すると、LCMでは5〜8倍長く、ペプチドスペクトルライブラリに提供されるサンプルが含まれていれば最大15倍も長く、解凍された条件下で大部分を占めます。さらに、LCMに必要な組織の追加の摂動(バックグラウンド染色、レーザー解剖)を考慮すると、LCMはCSDをほとんど得ず、もしも、与えた。したがって、CSDは、特にSEZのために、細胞外プロテオーム研究に適していると考えることができます。
特に、関心領域がSEZよりも小さい場合(例えば、最終的な細胞層のみを調査する)、自由なアプローチはLCMの精度に遅れをとります。例えば、若年層が細胞径幅のみであるため、PCCDを使用して皮下層からエペンディマルを分離することは困難であり、新鮮な凍結組織では肉眼では視差が見えない。したがって、50μm未満のスケールでの精密解剖が、乱れのない組織や解剖時間を短く保つよりも重要である場合、LCMはCSDよりも優れた選択肢となります。しかし、幅が50μm以上の領域では、CSDの精度はECMタンパク質分析のためのLCMの精度と同等です。
CSDは、神経性niche25におけるECMの機能的役割の調査に貢献することによって有用であることが既に証明されている。したがって、様々なタンパク質およびプロテオームの調査(あるいは単核RNAシーケンシング)にCSDを継続的に適用することは、さらなる神経新生調節因子、幹細胞活性化マーカー、およびSEZ幹細胞ニッチ学のより深い理解につながる可能性があります。老化したSEZ37における神経新生の減少を考慮すると、高齢マウスと若年マウスのSEZのECM変化の簡潔な分析は、NSCの発達と維持を促進する正確なニッチメカニズムの理解を促進するかもしれない38,39。さらに、SEZ神経新生に対する炎症および傷害の影響は十分に確立されている40,41,42,43。皮質脳損傷後のSEZにおける血液由来フィブリノーゲンの濃縮とSEZアストロリオジェネシスおよび瘢痕形成に及ぼす影響444は、外傷による微小環境変化がSEZ幹細胞生理学に及ぼす潜在的な影響を強調する。したがって、CSDを用いた脳損傷に関連してSEZ-ECMプロテオームを調査することは、傷害および炎症が神経新生に影響を与えるメカニズムを解明するのに役立つ可能性がある。重要なことに、この方法は、新鮮な凍結組織がしばしば手術から得ることができるので、健康と病気におけるヒト脳神経新生ニッチにも適用できる。さらに、成体神経新生における種差を考えると、CSD法を他の種、例えば線条性神経新生に関連して適用することも魅力的であろう。さらに、他のタンパク質検出法を用いて、SEZおよびMEZ(例えばELISA)に対してCSDを用いて、局所的に産生される成長因子の違いを正確かつ効率的に調査することができる。
最後に、解剖手順は、神経新生に関連しない研究問題のために、他の脳領域の正確な抽出のために変更される可能性があります。例えば、CSDは、コンパクトミエリンがより半透明の残留脳組織とは異なる白色領域として見える間、短い半解凍ステップを含む。この方法の簡単な変更により、この機能は、傷害関連の変化のプロテオミクス分析を受けることができる唯一の体のカオスカルサムコンパクトミエリン組織の正確な解剖を可能にするであろう。コーパス無数解離を可能にするプロトコル変更の提案は、プロトコルのステップ1.5-1.9を省略し、SEZとMEZをアクセス可能にするために心室を開く代わりにコロナセクションを準備することに直接進むということです。次に、ドライアイスの上にセクションを置き、スライスを少し持ち上げて半解凍し、メスでコーパスカオスを取り除きます。この調製は、ネイティブの脳梁組織の効率的な解剖を必要とするあらゆる分析の準備ができているはずです。
要約すると、この研究は、信頼性の高い心室神経原性ニッチプロテオーム分析に使用できるマイクロ解剖法を提示する。このデータは、CSD法の適合性と有用性を、SEZ微小環境のMSベースのプロテオミクス解析と共に強調している。精度、効率、および最小限の組織摂動の組み合わせは、CSDを既存の方法の貴重な拡張にします。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、彼の研究室で実験の大部分を実行することを可能にしたマティアス・マン、LCMとプロテオーム分析の助けを求めるファビアン・コシア、全体のマウント解剖のためのタチアナ・サイモン・エバート、そしてコルビニアン・マイヤーとイゴール・パロンの技術的な助けに心から感謝したいと思います。我々は、ドイツ研究評議会からMG(SFB870、TFR274)、EU(エラネットS-700982-5008-001)、ERC(aERC「NeuroCentro to MG」)、スウェーデン医学研究協会(SSMF、JKへの)博士助成、KI財団と資金(2020-013)への資金提供を感謝しています。
Cryostat CM3050S | Leica | ||
Dissecting microscope | Leica | ||
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
Antibodies | |||
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
Software | |||
GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
ZEN imaging software | Carl Zeiss |