크릴로 단부-해부는 깊은 정량적 프로테오메 분석을 위해 뮤린 뇌에서 가장 큰 신경 성 틈새 시장을 신선하고 냉동 준비 할 수 있습니다. 이 방법은 정확하고 효율적이며 최소한의 조직 혼란을 일으킵니다. 따라서, 그것은 이상적으로이 틈새 시장, 뿐만 아니라 다른 장기, 지역 및 종의 분자 미세 환경을 공부에 적합.
피하 신경 성 틈새 시장 측면 심실의 측면 심실 벽의 심실 리본으로 구성 됩니다. subependymal 영역 (SEZ)은 심실및 뇌척수액에 드러나는 얇고 뚜렷한 영역입니다. 이 틈새 시장을 분리하면 신경 줄기 세포 미세 환경의 분석을 할 수 있습니다. 그러나 프로테오메 분석을 위한 작은 조직을 추출하는 것은 특히 상당한 측정 깊이의 유지 보수와 신뢰할 수 있는 견고성의 성취를 위해 도전적입니다. 고정밀과 최소한의 조직 교란을 결합한 저온 절제부(CSD)라는 새로운 방법이 이러한 과제를 해결하기 위해 개발되었다. 이 방법은 풍부한 틈새 규제 기관을 감지할 수 있는 최첨단 질량 분석법(MS) 방법과 호환됩니다. 이 연구는 CSD와 프로테옴 데이터를 레이저 포획-마이크로절(LCM) 및 표준 전체마운트 해부에 의해 얻은 방법 및 데이터와 비교했습니다. CSD 방법은 LCM에 비해 준비 시간의 절반 미만으로 정량화 깊이의 두 배 미만을 초래하고 동시에 전체 마운트 해분의 해부 정밀도를 명확하게 능가하였다. 따라서, CSD는 프로테옴 분석을 위한 SEZ를 수집하는 우수한 방법입니다.
신경 발생은 성인 두뇌에 제한, 다양 한 중추 신 경계 복구 전략은 크게 성인 신경 교체의 기초의 증가 이해에서 혜택을 받을 것 이다. 설치류는 우리가 산후 신경 발생의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이되었습니다, 그것은 성인 신경 발생이 크게 종 의존한다는 것을 주의해야하지만. 마우스에는 3개의 성인 신경 줄기 세포 (NSC) 틈새가 있습니다. 시상 하 부 신경 성 잠재력을 가진 성인 NSC 틈새 시장1,2, 지속적인 성인 신경 발생은 주로 해 마에 제한 하는 동안3 그리고 측면 심실의 측면 벽의 SEZ4,5,6. SEZ는 트랜지케이팅 증폭 선조 세포(C 형 세포)를 통해 신경 폭발성(A형 세포)으로 발전하는 NSC(유형 B 세포)를 함유하는 가장 큰 발아 영역입니다. SEZ는 타입 B 세포의 20-35%, 타입 C 세포의 1-15%, 타입 A 세포의 1-30%, 및 연피 세포의 25-50%를 포함합니다7. SEZ는 내피 세포, 미세 글리아 세포 및 줄기 세포 틈새 에 거주 및 영향을 미치는 연골 세포와 복잡한 마이크로 아키텍처를 갖추고 있습니다8,9,10. 뉴런은 SEZ에서 부족하지만, 축축은 줄무늬, 복부 테지멘트 영역, 또는 시상 하부 도달 및 영향 유형 B 세포4와 같은 먼 소스에서 방출된다. 이 줄기 세포 틈새 의 독특한 특징은 증식 의 사이트와 분화 의 사이트 사이의 분리입니다. 증식 후, 신경 전구는 SEZ에서 후각 전구로 몇 밀리미터 이동하여 말단으로 뉴런으로 분화하고 기존의 신경 회로에 통합합니다. 신경 발생과 관련 된 세포 본질적인 프로그램에 대 한 조사는 이미 실험 치료 세포 재프로그래밍 및 이식 전략에 대 한 중요 한 지식을 제공 15,16,17,18,19,20. 그러나, 세포 외외 신호는 또한 신경 발생을 통제하고, 조직 환경은 줄기 세포의 신경 발생 운명을 결정할 수 있습니다11,12,14,21,22,23. 따라서 신경질적 틈새 의 미세 환경과 줄기 세포와의 상호 작용에 대한 조사는 매우 중요합니다.
세포 외 매트릭스 (ECM) 및 기타 분비 된 단백질은 마이크로 환경의 큰 부분입니다. 정확한 식별 및 정량화를 위해, 프로테오믹 접근법은 ECM24,25에 대한 전사와 단백질 수준 사이의 낮은 상관관계로 인해 ECM 조성물을 결정하는 전사적 접근법보다 더 적합합니다. 더욱이, SEZ의 틈새 규제 기관이 틈새 시장을 채우는 세포에 의해 독점적으로 생산되지 않는다는 실질적인 증거가 있습니다. 코로이드 신경총과 같은 더 먼 위치, 뇌척수액을 통해 줄기 세포로 전달되는 변조 신호를 분비22,23. 틈새 프로테오메를 조사하는 것은 세포 외 미세 환경의 상당 부분이 단백질에 의해 조립된다는 점을 감안할 때 생산 현장과 는 별개로 틈새 시장에서 존재하는 틈새 규제 기관을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
편견없는 프로테오믹 분석을 위해 뮤린 심실 영역을 수집하기 위해서는, 높은 정밀도를 가진 방법이 필요하며, 인접한 줄무늬의 조직을 배제하면서 줄기 세포를 포함하는 50 μm 얇은 심실 리본을 포착한다. 더욱이, 해부 중 조직 분동은 성장 인자 또는 사이토카인을 포함한 용해성 단백질이 쉽게 씻겨질 수 있기 때문에 세포외 미세 환경을 분석하기 위해 최소화되어야 한다. 고정 조직의 질량 스펙트럼을 분석할 수 있지만, 파라포름알데히드와 같은 필수 제제는 단백질 식별 깊이를 감소시키고 번역 후 수정을 도입할 수 있다. 형광 활성화 세포 선별 분석을 위한 세포의 수집을 위해 일반적인 전체 마운트 SEZ 해부는 가위26으로 전체 SEZ를 제거합니다. 이 표준 해부는 최소한의 조직 동요로 빠릅니다. 그러나 시료의 적지 오염은 피할 수 없습니다. 반대로 LCM은 우수한 해부 정밀도의 뛰어난 장점을 가지고 있습니다. 그러나, LCM은 조직 동요를 소개할 수 있습니다, 예를 들면, 배경 염색 또는 레이저 로 인한 단백질 성소 때문. 전체마운트 해부 및 LCM의 강점을 결합하기 위해, MS와 호환되는 새로운 방법, 극저온 단면 해부(CSD)라고 불림) 개발되었다(도 1A-D). CSD는 SEZ에 대한 이상적이고 대부분 비 신경성 제어 영역인 측면 심실(MEZ)의 내측 벽의 SEZ 및 SEZ의 해부를 추출할 수 있게 한다(프로토콜 참조). CSD와 최첨단 MS 방법의 조합에 의해 얻은 틈새 proteome이 성인 NSC 틈새 에서 새로운 규제 기관의 특성화 및 식별에 유용 한 것으로 판명되었다 25. 따라서, 이 방법은 SEZ 조직 단백질 조성물의 결정에 유용할 것이다.
CSD 방법은 SEZ 조직을 정밀하게 추출하고 MS를 사용하여 상당한 깊이로 신뢰할 수 있는 프로테옴을 생성할 수 있게 하였고, SEZ 샘플의 현저 오염 및 세포외 단백질 농축의 현저 오염을 크게 감소시켰습니다. CSD 및 전체 마운트 해부를 사용하여 개별 샘플(샘플당 6,500단백질)에서 유사한 수의 단백질을 검출할 수 있기 때문에 CSD의 추가 시간은 노력할 만한 가치가 있습니다. LCM은 보다 정확한 SEZ 해부를 제공하지만 CSD와 동일한 MS 프로토콜(라이브러리 매칭 및 라벨 없는 정량화)을 사용했음에도 불구하고 샘플당 3,500개의 단백질만으로 더 낮은 프로테오메 깊이에 도달했습니다. 중요한 것은, 가변성은 샘플 당 8배 더 긴 준비 시간으로 인해 훨씬 더 컸을 것입니다. LCM 및 CSD에 의해 얻어진 샘플의 PCA는 서로 강력하게 분리된 단단한 지역 별 클러스터를 가진 두 방법의 명확한 분리를 제시합니다. 대조적으로 LCM 샘플은 더 흩어져 분포를 보였으며, 이는 아마도 준비 기간 때문일 것입니다. 더 긴 기간 동안 훨씬 더 많은 샘플을 수집하는 것이 LCM과 동등한 견고성과 깊이의 proteome을 산출했을지 여부는 불분명합니다. 추정을 계산하고, CSD에 대해 수행된 유사한 샘플 부피를 수집하는 데는 LCM으로 5-8배 더 오래 걸리며, 펩타이드 스펙트럼 라이브러리에 제공된 샘플이 포함된 경우에도 최대 15배 이상 걸리며, 해동 된 조건 하에서 그 중 상당 부분은 해동된 조건하에서 그 중 상당부분을 차지한다. 더욱이, LCM (배경 염색, 레이저 해부)에 필요한 조직의 추가 혼란을 고려, LCM은 거의 제공, 있는 경우, CSD를 통해 이득. 따라서, CSD는 세포외 프로테오메 연구에 더 적합한 것으로 간주될 수 있다, 특히 SEZ에 대 한.
특히 관심 영역이 SEZ(예: 연피 세포 층만 조사)보다 작으면 자유손 접근법이 LCM의 정확도에 뒤쳐집니다. 예를 들어, CSD를 사용하여 경피층으로부터 연경을 분리하는 것은 연동층이 세포 직경이 넓고, 피연층을 향한 경계가 신선한 냉동 조직에서 육안으로 는 보이지 않기 때문에 어렵다. 따라서, LCM은 50 μm 이하의 척도에 정밀한 해부가 방해받지 않는 조직 또는 해부 시간을 짧게 유지하는 것보다 더 중요한 경우에 CSD 보다는 더 나은 선택이 될 것입니다. 그러나 폭이 50μm 이상인 영역의 경우 CSD의 정밀도는 ECM 단백질 분석을 위한 LCM의 정밀도와 유사합니다.
CSD는 이미 신경성 틈새 에서 ECM의 기능적 역할에 대한 조사에 기여함으로써 유용할 것으로 입증되었다. 따라서, 다양한 단백질 및 프로테옴 조사(또는 단하나 핵 RNA 시퀀싱)를 위해 SEZ에서 CSD를 지속적으로 적용하면 추가 신경 발생 조절제, 줄기 세포 활성화 마커 및 SEZ 줄기 세포 틈새 생리학에 대한 심층적인 이해가 발생할 수 있다. 노화SEZ37의 신경발생의 감소를 고려할 때, 노인과 젊은 쥐의 SEZ의 ECM 변화에 대한 간결한 분석은 NSC 개발 및 유지 보수를 육성하는 정확한 틈새 메커니즘에 대한 이해를 촉진할 수 있다38,39. 더욱이, SEZ 신경 발생에 염증과 부상의 영향은 잘 설립40,41,42,43. 피질 뇌 손상 후 SEZ에서 혈액 유래 피브리노겐의 농축과 SEZ 천체 발생 및 흉터 형성에 미치는 영향44 SEZ 줄기 세포 생리학에 외상 유발 미세 환경 변화의 잠재적 영향을 강조. 따라서 CSD를 사용하여 뇌 손상과 관련하여 SEZ-ECM proteome을 조사하는 것은 부상과 염증이 신경 발생에 영향을 미치는 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요한 것은, 그 방법은 또한 신선한 냉동 조직이 수시로 수술에서 얻을 수 있기 때문에 건강과 질병에 있는 인간 두뇌 신경생성 틈새소에 적용될 수 있었습니다. 더욱이, 성인 신경 발생에 있는 종 다름을 감안할 때, 그것은 또한 다른 종에 CSD 방법을 적용하는 것이 매혹적일 것입니다, 예를 들면, striatal 신경 발생에 협회에서. 더욱이, 다른 단백질 검출 방법을 통해, SEZ 및 MEZ(예를 들어, ELISA)를 위해 CSD를 사용하여 현지에서 생산된 성장 인자의 차이를 정확하고 효율적으로 조사할 수 있다.
마지막으로, 해부 절차는 잠재적으로 다른 뇌 영역의 정확한 추출을 위해 수정 될 수있다, 또한 신경 발생과 관련이없는 연구 질문에 대한. 예를 들어, CSD는 짧은 반 해동 단계를 포함, 그 동안 소형 myelin 더 반투명 잔류 뇌 조직에서 구별 흰색 영역으로 볼 수 있습니다. 방법의 간단한 수정으로,이 기능은 부상 관련 변화의 proteomic 분석을 실시 할 수있는 만 코퍼스 캘로섬 컴팩트 myelin 조직의 정확한 해부를 허용 할 것이다. 코퍼스 냉담해부를 허용하는 프로토콜 수정의 제안은 프로토콜의 1.5-1.9 단계를 생략하고 SEZ및 MEZ에 접근할 수 있도록 심실을 여는 대신 관상 섹션을 준비하는 것입니다. 그런 다음, 마른 얼음에 섹션을 놓고, 슬라이스를 잠시 들어 올리고 반 해동하고, 메스로 코퍼스 캘로섬을 제거하십시오. 이 준비는 이제 네이티브 코퍼스 캘로섬 조직의 효율적인 해부를 요구하는 모든 분석을 위해 준비되어야합니다.
요약하자면, 이 연구는 신뢰할 수 있는 심실 신경질 신경질 프로테오메 분석에 사용될 수 있는 마이크로 해부 방법을 제시합니다. 이 데이터는 SEZ 마이크로 환경의 MS 기반 프로테오믹 분석과 함께 CSD 방법의 호환성과 유용성을 강조합니다. 정밀도, 효율성 및 최소한의 조직 교란의 조합은 CSD를 기존 방법의 귀중한 확장으로 만듭니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 진심으로 우리가 자신의 실험실에서 실험의 큰 부분을 수행 할 수 있도록 마티아스 만, LCM 및 proteome 분석에 대한 도움을 파비안 코스시아, 전체 마운트 해부를위한 타티아나 사이먼 – 에버트, 그리고 코르비니안 메이어와 이고르 파론의 기술적 인 도움을 받고 싶습니다. 우리는 감사MG (SFB870, TFR274), 유럽 연합 (에라넷 S-700982-5008-001), ERC (AERC “NeuroCentro”에서 MG에), 스웨덴 의학 연구 협회 (SSMF, JK) 후 의사 보조금, 그리고 KI 재단 (JK 재단에 201,JK 기금)에 자금을 감사하게 인정합니다.
Cryostat CM3050S | Leica | ||
Dissecting microscope | Leica | ||
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
Antibodies | |||
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
Software | |||
GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
ZEN imaging software | Carl Zeiss |