Cryo-section-dissekering möjliggör färsk, fryst beredning av den största neurogena nischen i murin hjärnan för djup kvantitativ proteom analys. Metoden är exakt, effektiv och orsakar minimal vävnadsperturbation. Därför är den idealisk för att studera den molekylära mikromiljön av denna nisch, liksom andra organ, regioner och arter.
Subependymal neurogenic nisch består av ett paraventricular band av den laterala ventrikulära väggen i laterala ventrikel. Subependymal zonen (SEZ) är en tunn och distinkt region som utsätts för ventriklarna och ryggmärgsvätskan. Isoleringen av denna nisch möjliggör analys av en neurogen stamcellsmikromiljön. Extraktion av små vävnader för proteomanalys är dock utmanande, särskilt för upprätthållandet av betydande mätdjup och uppnåendet av tillförlitlig robusthet. En ny metod som kallas cryo-section-dissekering (CSD), som kombinerar hög precision med minimal vävnadsperturbation, utvecklades för att ta itu med dessa utmaningar. Metoden är kompatibel med toppmoderna metoder för masspektrometri (MS) som gör det möjligt att upptäcka låg rikliga nischregulatorer. I denna studie jämfördes CSD och dess proteomdata med den metod och data som erhållits genom laserinfångning-mikrodissection (LCM) och en standard för fullmount dissekering. CSD-metoden resulterade i dubbelt så stort kvantifieringsdjup på mindre än hälften av beredningstiden jämfört med LCM och överträffade samtidigt tydligt dissekeringsprecisionen för hela avelsen. Därför är CSD en överlägsen metod för att samla in SEZ för proteomanalys.
Eftersom neurogenes är begränsad i den vuxna hjärnan, olika centrala nervsystemet reparationsstrategier skulle dra stor nytta av en ökad förståelse för grunderna för vuxna neurala utbyte. Gnagare har hjälpt oss att förstå de grundläggande mekanismerna för postnatal neurogenes, även om det bör noteras att vuxen neurogenes är starkt artberoende. Hos möss finns det tre vuxna neurala stamceller (NSC) nischer. Hypotalamus är en vuxen NSC nisch med neurogenic potential1,2, medan kontinuerlig vuxen neurogenesis är främst begränsad till hippocampus3 och SEZ av laterala väggar i laterala Venttricles4,5,6. SEZ är den största groddregionen som innehåller NSCs (typ B-celler) som utvecklas till neuroblaster (typ A-celler) via transitförstärkande stamceller (typ C-celler). SEZ innehåller 20-35% av typ B-celler, 1-15% av typ C-celler, 1-30% av typ A-celler och 25-50% av ependymala celler7. SEZ har en komplex mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliaceller och ependymala celler som bor i och påverkar stamcellsnisch8,9,10. Även om nervceller är knappa i SEZ, axoner som härrör från avlägsna källor såsom striatum, ventrala tegmental området eller hypotalamus räckvidd och påverka typ B celler4. En unik egenskap hos denna stamcellsnisch är separationen mellan spridningsplatsen och differentieringsplatsen. Efter spridning migrerar neuronala stamceller flera millimeter från SEZ till luktlampan, där de terminalt differentierar sig i nervceller och integreras i befintliga neurala kretsar. Undersökningar av cell-inneboende program associerade med neurogenes har redan gett kunskap som är viktig för experimentella terapeutiska cell omprogrammering och transplantation strategier15,16,17,18,19,20. Cellextrinsiska signaler reglerar dock också neurogenes, och vävnadsmiljöer kan bestämma stamcellernas neurogena öde11,12,14,21,22,23. Följaktligen är undersökningen av mikromiljön av de neurogena nischerna och dess interaktion med stamcellerna av avgörande betydelse.
Den extracellulära matrisen (ECM) och andra utsöndrade proteiner är en stor del av mikromiljön. För korrekt identifiering och kvantifiering är ett proteomiskt tillvägagångssätt bättre lämpat än en transkriptomisk metod för att bestämma ECM sammansättning på grund av den låga korrelationen mellan transkriptom och proteinnivåer för ECM24,25. Dessutom finns det betydande bevis för att nischtillsynsmyndigheter i den exklusiva ekonomiska zon och den ekonomiska zon inte uteslutande produceras av celler som befolkar själva nischen. Mer avlägsna platser, såsom choroid plexus, utsöndrar modulerande signaler som överförs till stamcellerna via cerebrospinalvätskan22,23. Att undersöka nischproteom kan hjälpa till att identifiera nischregulatorer som finns i nischen oberoende av deras produktionsanläggning, med tanke på att en betydande del av den extracellulära mikromiljön monteras av proteiner.
För att samla murin ventrikulära zonen för opartisk proteomisk analys krävs en metod med hög precision, fånga ca. 50 μm tunt paraventrikulärt band som innehåller stamceller samtidigt som vävnaden i den intilliggande striatum. Dessutom måste vävnadsperturbation under dissekeringen minimeras för att analysera den extracellulära mikromiljön eftersom lösliga proteiner, inklusive tillväxtfaktorer eller cytokiner, lätt kan tvättas bort. Även om det är möjligt att analysera massspektrat av fast vävnad, kommer det nödvändiga medlet, såsom paraformaldehyd, att minska proteinidentifieringsdjupet och kan införa posttranslational modifieringar. En vanlig helmonterad SEZ-dissekering, t.ex. för insamling av celler för fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys, tar bort hela SEZ med sax26. Denna standard dissekering är snabb med minimal vävnadsperturbation. Striatal kontaminering av proverna kan dock inte undvikas. Omvänt har LCM den enastående fördelen med överlägsen dissekeringsprecision. LCM kan dock införa vävnadsperturbations, till exempel på grund av bakgrundsfärgning eller laser-orsakad protein denaturation. För att kombinera styrkorna i den helmonterade dissekeringen och LCM utvecklades en ny metod som är kompatibel med MS, så kallade cryo-section-dissekering (CSD), (figur 1A-D). CSD tillåter extraktion av SEZ och dissekering av SEZ av de mediala väggarna i laterala ventriklarna (MEZ), vilket är en idealisk, mestadels icke-neurogen kontrollregion för SEZ (se protokollet). Nisch proteom som erhållits genom kombinationen av CSD och state-of-the-art MS metoder visade sig vara användbart för karakterisering och identifiering av nya tillsynsmyndigheter i denna vuxna NSC nisch25. Därför kommer denna metod att vara användbar för bestämning av SEZ vävnadsproteinkomposition.
CSD-metoden gjorde det möjligt att exakt extrahera SEZ-vävnad och generera ett tillförlitligt proteom med betydande djup med ms CSD visar en klar fördel jämfört med helamount dissekering när det gäller kraftigt minskad striatal förorening av SEZ-prover och extracellulär proteinberikning. Eftersom det också är möjligt att upptäcka ett liknande antal proteiner i enskilda prover (~ 6 500 proteiner per prov) med CSD och fullmount dissekering, är den extra tiden för CSD väl värt ansträngningen. LCM ger mer exakt SEZ-dissekering men nådde ett lägre proteomdjup, med endast 3 500 proteiner per prov trots att de använde samma MS-protokoll som CSD (biblioteksmatchning och etikettfri kvantifiering). Viktigt är att variationen var mycket större, förmodligen på grund av den åttafaldiga längre förberedelsetiden per prov. PCA av de prover som erhållits av LCM och CSD avslöjar en tydlig separation av båda metoderna med snäva regionspecifika kluster som är robust åtskilda från varandra. Däremot visade LCM-proverna en mer spridd fördelning, vilket förmodligen delvis beror på beredningens längd. Det är oklart om insamlingen av betydligt fler prover under en längre period skulle ha gett ett proteom av samma robusthet och djup med LCM. Att beräkna en uppskattning, samla in en liknande provvolym som gjorts för CSD skulle ta 5-8 gånger längre tid med LCM, även upp till 15 gånger längre om prover som tillhandahålls för peptidspektrabiblioteken inkluderades, och mycket av det under tinade förhållanden. Med tanke på de ytterligare störtingarna av vävnaden som är nödvändig för LCM (bakgrundsfärgning, laser dissekering), gav LCM liten, om någon, vinst över CSD. Därför kan CSD anses vara mer lämpligt för extracellulär proteomforskning, särskilt för SEZ.
Om intresseområdet är mindre än den särskilda ekonomiska zon (t.ex. att endast undersöka ependymalcellskiktet) ligger en frihandsmetod bakom LCM:s noggrannhet. Att till exempel använda CSD för att separera ependymalt från det subependymala skiktet är svårt eftersom ependymalskiktet bara är en celldiameter bred och avgränsningen mot det subependymala skiktet inte är synlig för blotta ögat i färsk frusen vävnad. LCM är därför ett bättre val än CSD om en exakt dissekering på en skala under 50 μm är viktigare än ostörd vävnad eller håller dissekeringstiden kort. För regioner med en bredd på 50 μm och mer är dock precisionen hos CSD jämförbar med den för LCM för ECM-proteinanalys.
CSD har redan visat sig vara användbart genom att bidra till undersökningen av ECM: s funktionella roll i den neurogena nischen25. Därför kan den fortsatta tillämpningen av CSD i SEZ för olika protein- och proteomundersökningar (eller till och med enkärniga RNA-sekvensering) leda till detektion av ytterligare neurogenesregulatorer, stamcellsaktiveringsmarkörer och en djupare förståelse för SEZ stamcells nischfysiologi. Med tanke på minskningen av neurogenes i åldrande SEZ37, en kortfattad analys av ECM förändringar av SEZ av äldre kontra unga möss kan främja förståelsen av de exakta nischmekanismer som främjar NSC utveckling och underhåll38,39. Dessutom är påverkan av inflammation och skada på SEZ neurogenes väl etablerad40,41,42,43. Berikning av blod-härledda fibrinogen i SEZ efter när hjärnskada och dess inflytande på SEZ astrogliogenes och ärr bildas44 belyser den potentiella påverkan av trauma-inducerad mikromiljö förändringar på SEZ stamcell fysiologi. Därför kan undersöka SEZ-ECM proteom i samband med hjärnskada med CSD hjälpa till att klargöra mekanismerna genom vilka skada och inflammation påverkar neurogenes. Viktigt är att metoden också kan tillämpas på humana hjärnneurogena nischer i hälsa och sjukdom eftersom färsk frusen vävnad ofta kan erhållas från operationer. Med tanke på artskillnaderna i vuxenneurogenes skulle det dessutom vara fascinerande att tillämpa CSD-metoden på andra arter, t.ex. i samband med striatal neurogenes. Med andra proteindetekteringsmetoder kan dessutom skillnader i lokalt producerade tillväxtfaktorer undersökas noggrant och effektivt med hjälp av CSD för SEZ och MEZ (t.ex. ELISA).
Slutligen kan dissekeringsförfarandet potentiellt ändras för korrekt extraktion av andra hjärnregioner, även för forskningsfrågor som inte är relaterade till neurogenes. Till exempel innehåller CSD ett kort halvupptiningssteg, under vilket kompakt myelin är synligt som vita områden som skiljer sig från den mer genomskinliga kvarvarande hjärnvävnaden. Med en enkel modifiering av metoden skulle denna funktion tillåta den exakta dissekeringen av endast corpus callosum kompakt myelin vävnad, som kan utsättas för proteomic analys av skada-relaterade förändringar. Ett förslag om en protokolländring som skulle tillåta corpus callous dissekering är att utelämna steg 1.5-1.9 av protokollet och fortsätta direkt till att förbereda koronal avsnitt istället för att öppna ventriklarna för att göra SEZ och MEZ tillgängliga. Placera sedan sektionerna på torr is, lyft och halv tina skivorna kort och ta helt enkelt bort corpus callosum med en skalpell. Detta preparat bör nu vara redo för alla analyser som kräver en effektiv dissekering av infödda corpus callosum vävnad.
Sammanfattningsvis presenterar denna studie en mikro-dissekeringsmetod som kan användas för tillförlitlig ventrikulärt neurogen nisch proteom analys. Uppgifterna understryker kompatibiliteten och nyttan av CSD-metoden tillsammans med MS-baserad proteomisk analys av mikromiljön för SEZ. Kombinationen av precision, effektivitet och minimal vävnadsperturbation gör CSD till en värdefull förlängning av befintliga metoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill uppriktigt tacka Mathias Mann för att ha tillåtit oss att utföra stora delar av experimenten i hans laboratorium, Fabian Coscia för hjälp med LCM och proteomanalys, Tatiana Simon-Ebert för hela avdissektioner och Korbinian Mayr och Igor Paron för deras tekniska hjälp. Vi erkänner tacksamt finansiering från det tyska forskningsrådet till MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC “NeuroCentro” till MG), Svenska sällskapet för medicinsk forskning (SSMF, till JK) postdoktoralt bidrag och KI-stiftelser och fonder (2020-01351, till JK).
Cryostat CM3050S | Leica | ||
Dissecting microscope | Leica | ||
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
Antibodies | |||
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
Software | |||
GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
ZEN imaging software | Carl Zeiss |