Kryo-sektion-dissektion tillader frisk, frossen forberedelse af den største neurogene niche i murinhjernen til dyb kvantitativ proteomanalyse. Metoden er præcis, effektiv, og forårsager minimal vævforstyrrelse. Derfor er det ideelt egnet til at studere det molekylære mikromiljø af denne niche samt andre organer, regioner og arter.
Den subependymale neurogene niche består af et paraventrikulært bånd af den laterale ventrikulære væg af den laterale ventrikel. Den subependymale zone (SEZ) er en tynd og særskilt region udsat for hjertekamre og cerebrospinalvæske. Isoleringen af denne niche gør det muligt at analysere et neurogent stamcellemikromiljø. Ekstraktion af små væv til proteomanalyse er imidlertid en udfordring, især for vedligeholdelsen af betydelig måledybde og opnåelse af pålidelig robusthed. En ny metode, der kaldes kryosektionsdektion (CSD), der kombinerer høj præcision med minimal vævsforstyrrelse, blev udviklet for at løse disse udfordringer. Metoden er kompatibel med state-of-the-art massespektrometri (MS) metoder, der tillader påvisning af lav-rigelige niche regulatorer. Denne undersøgelse sammenlignede CSD og dets proteomdata med den metode og de data, der blev opnået ved laser-capture-microdissection (LCM) og en standard dissektion af helemount. CSD-metoden resulterede i dobbelt kvantificeringsdybde på mindre end halvdelen af forberedelsestiden sammenlignet med LCM og udkonkurrerede samtidig klart dissektionspræcisionen af helmonte dissektionen. Derfor er CSD en overlegen metode til indsamling af SEZ til proteomanalyse.
Som neurogenese er begrænset i den voksne hjerne, forskellige centralnervesystemet reparation strategier ville i høj grad drage fordel af en øget forståelse af grundlaget for voksne neurale udskiftning. Gnavere har hjulpet os med at forstå de grundlæggende mekanismer i postnatal neurogenese, selvom det skal bemærkes, at voksen neurogenese er meget artsafhængig. I mus er der tre voksne neurale stamceller (NSC) nicher. Hypothalamus er en voksen NSC niche med neurogene potentiale1,2, mens kontinuerlig voksen neurogenese er hovedsageligt begrænset til hippocampus3 og SEZ af de laterale vægge af de laterale hjertekamre4,5,6. SEZ er den største germinale region, der indeholder NSC’er (type B-celler), der udvikler sig til neuroblaster (type A-celler) via transitforstærkende stamfaderceller (type C-celler). SEZ indeholder 20-35% af type B-celler, 1-15% af type C-celler, 1-30% af type A-celler og 25-50% af ependymale celler7. SEZ har en kompleks mikroarkitektur, med endotelceller, mikrogliale celler, og ependymale celler bosat i og påvirke stamcelle niche8,9,10. Selv om neuroner er knappe i SEZ, axoner stammer fra fjerne kilder såsom striatum, ventral tegmental område, eller hypothalamus nå og påvirke type B celler4. Et unikt træk ved denne stamcelle niche er adskillelsen mellem stedet for spredning og stedet for differentiering. Efter spredning migrerer neuronale forfædre flere millimeter fra SEZ til den olfaktoriske pære, hvor de terminalt differentierer sig i neuroner og integreres i allerede eksisterende neurale kredsløb. Undersøgelser af celle-iboende programmer forbundet med neurogenese har allerede givet viden vigtigt for eksperimentel terapeutisk celle omprogrammering og transplantation strategier15,16,17,18,19,20. Men, celle-extrinsiske signaler også regulere neurogenese, og væv miljøer kan bestemme neurogene skæbne stamceller11,12,14,21,22,23. Derfor er undersøgelsen af mikromiljøet af de neurogene nicher og dets interaktion med stamcellerne af afgørende betydning.
Den ekstracellulære matrix (ECM) og andre udskillede proteiner er en stor del af mikromiljøet. For nøjagtig identifikation og kvantificering er en proteomisk tilgang bedre egnet end en transskriptom tilgang til at bestemme ECM-sammensætning på grund af den lave korrelation mellem transskriptom og proteinniveauer for ECM24,25. Desuden er der væsentlige beviser for, at nicheregulatorer i SEZ ikke udelukkende produceres af celler, der befolker selve nichen. Fjernere steder, såsom choroid plexus, udskiller modulerende signaler, der sendes til stamceller via cerebrospinalvæsken22,23. Undersøgelse af niche proteom kan bidrage til at identificere niche regulatorer til stede i nichen uafhængigt af deres produktionsanlæg, da en betydelig del af den ekstracellulære mikromiljø er samlet af proteiner.
For at indsamle murin ventrikulær zone for upartisk proteomisk analyse, en metode med høj præcision er nødvendig, indfange ca. 50 μm tynde paraventrikulære bånd, der indeholder stamceller, mens du udelukker væv af den tilstødende striatum. Desuden skal vævsforstyrrelser under dissektionen minimeres til analyse af det ekstracellulære mikromiljø, fordi opløselige proteiner, herunder vækstfaktorer eller cytokiner, let kan vaskes væk. Selv om det er muligt at analysere massespektre af fast væv, det krævede middel, såsom paraformaldehyd, vil reducere protein identifikation dybde og kan indføre posttranslationelle ændringer. En fælles SEZ-dissektion med helemount, f.eks. til indsamling af celler til fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse, fjerner hele SEZ med en saks26. Denne standard dissektion er hurtig med minimal vævsforstyrrelse. Striatal forurening af prøverne kan dog ikke undgås. Omvendt har LCM den enestående fordel af overlegen dissektion præcision. LCM kan dog indføre vævsforstyrrelser, for eksempel på grund af baggrundsfarvning eller laserbaseret proteindeaturering. For at kombinere styrkerne i helmount dissektion og LCM, en ny metode, der er kompatibel med MS, kaldes cryo-sektion-dissektion (CSD), blev udviklet (Figur 1A-D). CSD tillader udvinding af SEZ og dissektion af SEZ af de mediale vægge af de laterale hjertekamre (MEZ), som er en ideel, for det meste ikke-neurogen kontrol region for SEZ (se protokollen). Niche proteom opnået ved kombinationen af CSD og state-of-the-art MS metoder viste sig at være nyttige for karakterisering og identifikation af nye tilsynsmyndigheder i denne voksne NSC niche25. Derfor vil denne metode være nyttig til bestemmelse af SEZ vævsproteinsammensætning.
CSD-metoden gjorde det muligt præcist at udtrække SEZ-væv og generere et pålideligt proteom med betydelig dybde ved hjælp af MS. CSD viser en klar fordel i forhold til helmonteret dissektion i form af stærkt reduceret striatal forurening af SEZ-prøver og ekstracellulær proteinberigelse. Da det også er muligt at opdage et lignende antal proteiner i individuelle prøver (~ 6.500 proteiner pr. Prøve) med CSD og helmonteret dissektion, er den ekstra tid til CSD umagen værd. LCM giver mere præcis SEZ dissektion, men nåede en lavere proteom dybde, med kun 3.500 proteiner pr prøve på trods af at bruge den samme MS protokol som CSD (bibliotek matching og label-fri kvantificering). Det er vigtigt, at variationen var meget større, sandsynligvis på grund af den ottefoldige længere forberedelsestid pr. prøve. PCA af prøverne fra LCM og CSD afslører en klar adskillelse af begge metoder med stramme regionsspecifikke klynger, der er solidt adskilt fra hinanden. I modsætning hertil viste LCM-prøverne en mere spredt fordeling, hvilket sandsynligvis til dels skyldes forberedelseslængden. Det er uklart, om indsamling af langt flere prøver over en længere periode ville have givet et proteom af samme robusthed og dybde med LCM. Beregning af et skøn, indsamling af en lignende prøve volumen som gjort for CSD ville tage 5-8 gange længere med LCM, selv op til 15 gange længere, hvis prøver til peptid spektre biblioteker blev medtaget, og meget af det under optøet betingelser. I betragtning af de yderligere forstyrrelser af vævet, der er nødvendige for LCM (baggrundsfarvning, laser dissektion), LCM forudsat lidt, hvis nogen, gevinst over CSD. Derfor kan CSD anses for mere egnet til ekstracellulær proteom forskning, specielt til SEZ.
Især hvis interesseområdet er mindre end SEZ (f.eks. kun ved at undersøge det ependymale cellelag), falder en frihåndstilgang bagud i forhold til LCM’ens nøjagtighed. For eksempel er det svært at bruge CSD til at adskille ependymalt fra det subependymale lag, da det ependymale lag kun er en cellediameter bred, og afgrænsningen mod det subependymale lag er ikke synligt for det blotte øje i frisk frosset væv. Derfor vil LCM være et bedre valg end CSD, hvis en præcis dissektion på en skala under 50 μm er vigtigere end uforstyrret væv eller holde dissektionstiden kort. For regioner med en bredde på 50 μm og derover kan CSD’s præcision imidlertid sammenlignes med LCM’s for ECM-proteinanalyse.
CSD har allerede vist sig at være nyttig ved at bidrage til undersøgelsen af ECM’ens funktionelle rolle i den neurogene niche25. Derfor kan den fortsatte anvendelse af CSD i SEZ for forskellige protein- og proteomundersøgelser (eller endda single-nucleus RNA-sekventering) føre til påvisning af yderligere neurogeneseregulatorer, stamcelleaktiveringsmarkører og en dybere forståelse af SEZ-stamcelle nichefysiologi. I betragtning af nedgangen i neurogenese i den aldrende SEZ37, en kortfattet analyse af ECM ændringer af SEZ af alderen vs unge mus kan fremme forståelsen af de nøjagtige niche mekanismer fremme NSC udvikling og vedligeholdelse38,39. Desuden er indflydelsen af betændelse og skade på SEZ neurogenese veletableret40,41,42,43. Berigelsen af blod-afledt fibrinogen i SEZ efter kortikale hjerneskade og dens indflydelse på SEZ astrogliogenese og ar dannelse44 fremhæver den potentielle indflydelse af traume-induceret mikromiljø ændringer på SEZ stamcelle fysiologi. Derfor, undersøge SEZ-ECM proteom i forbindelse med hjerneskade ved hjælp af CSD kunne hjælpe belyse de mekanismer, hvorved skade og betændelse påvirker neurogenese. Det er vigtigt, at metoden også kan anvendes på neurogene nicher i mennesker i sundhed og sygdom, da frisk frosset væv ofte kan opnås ved operationer. I betragtning af arternes forskelle i voksen neurogenese ville det desuden også være fascinerende at anvende CSD-metoden på andre arter, f.eks. i forbindelse med striatal neurogenese. Desuden kan forskelle i lokalt producerede vækstfaktorer med andre proteindetektionsmetoder undersøges præcist og effektivt ved hjælp af CSD for SEZ og MEZ (f.eks. ELISA).
Endelig kan dissektionsproceduren potentielt ændres til nøjagtig udvinding af andre hjerneområder, også til forskningsspørgsmål, der ikke er relateret til neurogenese. For eksempel, CSD indeholder en kort semi-optøning trin, hvor kompakt myelin er synlig som hvide områder adskiller sig fra de mere gennemskinnelige resterende hjernevæv. Med en simpel ændring af metoden, ville denne funktion tillade præcis dissektion af kun corpus callosum kompakt myelin væv, som kunne udsættes for proteomisk analyse af skade-relaterede ændringer. Et forslag til en protokol ændring, der ville gøre det muligt for corpus afstumpede dissektion er at udelade trin 1.5-1.9 i protokollen og gå direkte til at forberede koronar sektioner i stedet for at åbne hjertekamrene for at gøre SEZ og MEZ tilgængelige. Derefter placeres sektionerne på tøris, løft og halvø skiverne, og fjern simpelthen corpus callosum med en skalpel. Dette præparat bør nu være klar til enhver analyse, der kræver en effektiv dissektion af indfødte corpus callosum væv.
Sammenfattende præsenterer denne undersøgelse en mikrodektionsmetode, der kan bruges til pålidelig ventrikulær neurogen nicheproomanalyse. Dataene understreger CSD-metodens kompatibilitet og anvendelighed sammen med MS-baseret proteomisk analyse af SEZ-mikromiljøet. Kombinationen af præcision, effektivitet og minimal vævsforstyrrelse gør CSD til en værdifuld udvidelse af eksisterende metoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne oprigtigt takke Mathias Mann for at give os mulighed for at udføre store dele af forsøgene i hans laboratorium, Fabian Coscia for hjælp med LCM og proteom analyse, Tatiana Simon-Ebert for wholemount dissektioner, og Korbinian Mayr og Igor Paron for deres tekniske hjælp. Vi anerkender taknemmeligt finansieringen fra det tyske forskningsråd til MG (SFB870, TFR274), EU (Eranet S-700982-5008-001), ERC (aERC “NeuroCentro” til MG), Swedish Society for Medical Research (SSMF, til JK) postdoc-tilskud og KI-fonde og fonde (2020-01351 til JK).
Cryostat CM3050S | Leica | ||
Dissecting microscope | Leica | ||
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip | Fine Science Tools | cat. no. 11252-00 | |
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 | Invitrogen | cat. no. 24020 | |
HEPES buffer solution (1 M) | Invitrogen | cat. no. 15630 | |
Microscope slides | RS France | cat. no. BPB018 | |
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL | Eppendorf | cat. no. 0030123344 | |
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm | Fine Science Tools | cat. no. 15003-08 | |
Surgical disposable scalpels | B. Braun | cat. no. 5518083 | |
Tissue culture dishes 60 mm | Greiner Bio-One | cat. no. 633180 | |
Antibodies | |||
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) | ThermoFisher Scientific | cat. no. A-11001 | |
DAPI | Sigma | cat. no. D9542 | |
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 | Millipore | cat. no. AB2253, | |
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 | Sigma | cat. no. G3893 | |
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 | Millipore | cat. no. MAB1567 | |
Software | |||
GraphPad Prism version 9 | GraphPad Software, San Diego California USA | www.graphpad.com | |
Perseus Version 1.6.10.50 | Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany | https://maxquant.net/perseus/ | |
ZEN imaging software | Carl Zeiss |