Cribado de genotipos de tabaco para la resistencia a Phytophthora nicotianae
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para la detección eficiente y precisa de genotipos de tabaco para la resistencia a Phytophthora nicotianae en plántulas. Este es un enfoque práctico para la cría de precisión, así como para la investigación de mecanismos moleculares.
Abstract
El vástago negro, causado por los oomicetos Phytophthora nicotianae, es destructivo para el tabaco, y este patógeno es altamente patógeno para muchos cultivos solanáceos. P. nicotianae está bien adaptado a las altas temperaturas; por lo tanto, la investigación sobre este patógeno está ganando importancia en la agricultura de todo el mundo debido al calentamiento global. Las variedades de plantas de tabaco resistentes a P. nicotianae se examinan comúnmente mediante inoculación con granos de avena colonizados por P. nicotianae y monitoreo de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, es difícil cuantificar la intensidad de la inoculación ya que la inoculación precisa es crucial en este caso. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un método eficiente y confiable para evaluar la resistencia del tabaco a la infección por P. nicotianae. Este método se ha utilizado con éxito para identificar variedades resistentes, y la eficiencia de la inoculación se confirmó mediante PCR en tiempo real. El método de evaluación de la resistencia presentado en este estudio es eficiente y práctico para la cría de precisión, así como para la investigación de mecanismos moleculares.
Introduction
P. nicotianae es destructivo para muchos cultivos solanáceos. Puede causar “vástago negro”1 del tabaco, podredumbre foliar y tubérculo de patata2, podredumbre de la corona y la raíz del tomate y el pimiento dulce3, y podredumbre del collar y la raíz de Goji4. P. nicotianae puede atacar todas las partes de las plantas de tabaco, incluidas las raíces, tallos y hojas en cualquier etapa de crecimiento5. El síntoma más común de la enfermedad es la base negra del tallo. Las raíces son inicialmente visibles como empapadas en agua y luego se vuelven necróticas, y las hojas muestran grandes lesiones circulares5. Esta enfermedad puede ser devastadora para una planta de tabaco en el invernadero, así como en el campo6. El método más práctico y económico para controlar P. nicotianae es el uso de variedades resistentes7. Sin embargo, se requiere un protocolo de detección eficaz para la identificación de accesiones resistentes a P. nicotianae de las colecciones de germoplasma de tabaco.
Se han descrito diversos métodos de identificación para evaluar la resistencia a P. nicotianae en el tabaco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. En general, se han utilizado tres enfoques principales para la identificación de genotipos de tabaco resistentes a P. nicotianae. El primero incluye mezclar micelios con medio agar en placas de Petri que contengan P. nicotianae. Los micelios se cultivan en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 semanas. Se añade 1 L de agua desionizada al micelio y se homogeneiza durante 30 s. El inóculo se mantiene en hielo hasta que sea necesario. Se hacen dos agujeros (1 cm de diámetro y 4-5 cm de profundidad) a cada lado de la planta, y se vierten 10 ml del inóculo en cada agujero. Los agujeros se llenan con el suelo circundante, y el desarrollo de enfermedades se monitorea diariamente durante 2 semanas8,10.
En el segundo método, las plantas se inoculan con palillos de dientes infestados de patógenos. Para este enfoque, las plantas deben usarse aproximadamente 6 semanas después del trasplante y deben tener una altura mínima de 30 cm. Los palillos de dientes en autoclave se colocan en la superficie de cultivos que contienen micelio de P. nicotianae. Los platos de cultivo se almacenan bajo la luz a temperatura ambiente durante 7 días. Luego, los palillos de dientes colonizados se utilizan para inocular las plantas. Los palillos de dientes se insertan en los tallos del tabaco entre el cuarto y quinto ganglio. Las plantas son monitoreadas diariamente durante 5 días9,15. Este método no es aplicable para plántulas pequeñas. Como el inóculo son palillos de dientes infestados de patógenos, la intensidad de la inoculación no se puede controlar con precisión.
El enfoque más utilizado involucra granos de avena para la inoculación. En este caso, los granos de avena se preparan en autoclave 500 ml de avena y 300 ml de agua desionizada a 121 °C durante 1 h una vez al día durante 3 días. Luego, los granos de avena se agregan al medio de cultivo colonizado por patógenos. Los platos se sellan con película de parafina y se incuban a 25 °C a la luz durante 7-12 días. Se hacen cuatro agujeros separados de 5 cm de profundidad en el suelo para macetas, a 4 cm de cada planta, y se coloca un grano de avena infestado de patógenos en cada agujero. El período de incubación se determina en función de cuándo se produce el primer síntoma sobre el suelo7,11,12,13,14,15,16. Este método es eficiente y aplicable para el cribado de resistencia a gran escala. Sin embargo, una limitación de este enfoque es que el inóculo son granos de avena infestados de patógenos, por lo tanto, la intensidad de la inoculación no se puede controlar con precisión.
Sin embargo, aquí se presenta un método más preciso que es aplicable a la evaluación de la resistencia de la cámara de crecimiento. En comparación con los otros enfoques, el inóculo es suspensión de zoosporas, por lo tanto, la intensidad de la inoculación es controlable y ajustable. Como las plantas de tabaco en este estudio se cultivan sin tierra, los resultados son más fáciles de observar. Además, el muestreo de las raíces de las plantas del suelo siempre causa daños en las raíces, lo que induce una serie de respuestas fisiológicas17. En este método, como las plantas se cultivan sin tierra, se puede eliminar la interferencia en el daño de la raíz. En conclusión, este método es más práctico para la investigación de mecanismos moleculares y la cría de precisión. Usando este protocolo, los datos generalmente se obtienen dentro de los 5 días, con más de 200 plantas evaluadas en un solo experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han utilizado múltiples fuentes de resistencia para mejorar la resistencia de P. nicotianae en el tabaco cultivado. Los genes R dominantes individuales, Php y Phl, han sido introgresados a partir de Nicotiana plumbaginifolia y Nicotiana longiflora, respectivamente10. La variedad de tabaco de cigarro Beinhart 1000 tiene el nivel más alto reportado de resistencia cuantitativa a P. nicotianae13. Múltiples experimentos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31571738) y el Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola de China (ASTIP-TRIC01).
Materials
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
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