Mesure de la capacité d’importation de protéines des mitochondries du muscle squelettique
Summary
Les mitochondries sont des organites métaboliques clés qui présentent un niveau élevé de plasticité phénotypique dans le muscle squelettique. L’importation de protéines du cytosol est une voie critique pour la biogenèse des organites, essentielle à l’expansion du réticulum et au maintien de la fonction mitochondriale. Par conséquent, l’importation de protéines sert de baromètre de la santé cellulaire.
Abstract
Les mitochondries sont des organites métaboliques et régulateurs clés qui déterminent l’approvisionnement en énergie ainsi que la santé globale de la cellule. Dans le muscle squelettique, les mitochondries existent dans une série de morphologies complexes, allant de petits organites ovales à un large réseau en forme de réticulum. Comprendre comment le réticulum mitochondrial se dilate et se développe en réponse à divers stimuli tels que les altérations de la demande d’énergie est depuis longtemps un sujet de recherche. Un aspect clé de cette croissance, ou biogenèse, est l’importation de protéines précurseurs, codées à l’origine par le génome nucléaire, synthétisées dans le cytosol et translocalisées dans divers sous-compartiments mitochondriaux. Les mitochondries ont développé un mécanisme sophistiqué pour ce processus d’importation, impliquant de nombreux canaux membranaires internes et externes sélectifs, connus sous le nom de machinerie d’importation de protéines (PIM). L’importation dans la mitochondrie dépend du potentiel membranaire viable et de la disponibilité de l’ATP dérivé des organites par phosphorylation oxydative. Par conséquent, sa mesure peut servir de mesure de la santé des organites. Le PIM présente également un haut niveau de plasticité adaptative dans le muscle squelettique qui est étroitement couplé à l’état énergétique de la cellule. Par exemple, il a été démontré que l’entraînement physique augmente la capacité d’importation, tandis que la désutilisation musculaire la réduit, coïncidant avec des changements dans les marqueurs du contenu mitochondrial. Bien que l’importation de protéines soit une étape critique dans la biogenèse et l’expansion des mitochondries, le processus n’est pas largement étudié dans le muscle squelettique. Ainsi, cet article explique comment utiliser des mitochondries isolées et entièrement fonctionnelles du muscle squelettique pour mesurer la capacité d’importation de protéines afin de promouvoir une meilleure compréhension des méthodes impliquées et une appréciation de l’importance de la voie du renouvellement des organites dans l’exercice, la santé et la maladie.
Introduction
Les mitochondries sont des organites qui existent dans des morphologies complexes dans différents types de cellules et sont reconnus pour posséder un éventail croissant de fonctions essentielles à la santé cellulaire. En tant que tels, ils ne peuvent plus être réduits à de simples organites producteurs d’énergie. Les mitochondries sont des régulateurs métaboliques clés, des déterminants du devenir cellulaire et des centres de signalisation, dont les fonctions peuvent servir d’indicateurs utiles de la santé cellulaire globale. Dans les cellules musculaires squelettiques, les études de microscopie électronique révèlent la présence de mitochondries sous-sarmateuses (SS) et intermyofibrillaires (IMF) géographiquement distinctes, qui présentent un degré de connectivité1,2,3,4 qui est maintenant reconnu comme étant très dynamique et adaptable aux changements dans les niveaux d’activité musculaire squelettique, ainsi qu’avec l’âge et la maladie. Le contenu et la fonction mitochondriaux dans les muscles peuvent être évalués de nombreuses façons5,6, et des méthodes traditionnelles d’isolement des organites ont été appliquées pour mieux comprendre les capacités respiratoires et enzymatiques (Vmax) des mitochondries distinctes de l’influence du milieu cellulaire7,8. En particulier, ces méthodes traditionnelles ont révélé des distinctions biochimiques subtiles entre les mitochondries isolées des régions sous-sarmateuses et intermyofibrillaires, démentant les implications fonctionnelles possibles pour le métabolisme dans ces régions subcellulaires8,9,10,11.
La biogenèse des mitochondries est unique en ce sens qu’elle nécessite la contribution de produits géniques de l’ADN nucléaire et mitochondrial. Cependant, la grande majorité d’entre eux sont dérivés du noyau puisque la transcription de l’ADNmt ne conduit qu’à la synthèse de 13 protéines. Étant donné que les mitochondries comprennent normalement >1000 protéines impliquées dans diverses voies métaboliques, la biogenèse de l’organite nécessite un moyen étroitement régulé d’importation et d’assemblage des protéines précurseurs du cytosol dans les différents sous-compartiments mitochondriaux pour maintenir une stœchiométrie et une fonction appropriées12,13. Les protéines codées par le nucléaire destinées aux mitochondries portent normalement une séquence de ciblage mitochondrial (MTS) qui les cible vers l’organite et facilite leur localisation sous-compartimentale. La plupart des protéines liées à la matrice contiennent un MTS N-terminal clivable, tandis que celles destinées à la membrane mitochondriale externe ou interne ont généralement des domaines de ciblage internes14. Le processus d’importation est effectué par un ensemble de canaux divers qui offrent de multiples voies d’entrée dans l’organite13. La translocase du complexe de membrane externe (TOM) transporte les précurseurs du cytosol dans l’espace intermembranaire, où ils sont reconnus par la translocase du complexe de membrane interne (TIM). Ce complexe est responsable de l’importation de précurseurs codés par le nucléaire dans la matrice, où les protéases clivent la préséquence de ciblage N-terminal. Les protéines destinées à la membrane externe peuvent être directement insérées dans cette membrane à travers le complexe TOM, tandis que celles destinées à la membrane interne sont insérées par une protéine TIM, en particulier TIM22. Après leur importation, les protéines sont ensuite traitées par les protéases et les chaperons résidents et se combinent souvent pour former des complexes plus grands, tels que ceux trouvés dans la chaîne de transport d’électrons.
L’importation de protéines mitochondriales elle-même sert également de mesure de la santé mitochondriale, car ce processus repose sur la présence d’un potentiel membranaire et d’une source d’énergie sous forme d’ATP15. Par exemple, lorsque le potentiel membranaire est dissipé, la protéine kinase PINK1 ne peut pas être absorbée par l’organite, ce qui conduit à des signaux de phosphorylation qui déclenchent l’apparition de la dégradation de l’organite par une voie appelée mitophagie16,17. Dans des circonstances similaires, lorsque l’importation est entravée, la protéine ATF5 ne peut pas pénétrer dans l’organite, et elle se transloque ensuite vers le noyau, où elle sert de facteur de transcription pour la régulation à la hausse de l’expression du gène UPR18,19. Ainsi, la mesure de l’efficacité de l’importation de protéines peut fournir un aperçu complet de la santé de l’organite, tandis que la réponse à l’expression génique peut être utilisée pour indiquer le degré de signalisation rétrograde au noyau.
Malgré son importance évidente pour la biogenèse des mitochondries et pour la santé cellulaire en général, la voie d’importation dans les mitochondries des mammifères est remarquablement sous-étudiée. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes spécifiques impliquées dans la mesure de l’importation de protéines précurseurs dans les mitochondries des muscles squelettiques et fournissons des données pour illustrer la réponse adaptative du système d’importation aux changements musculaires et à la désuétude, illustrant la contribution de l’importation de protéines à la plasticité adaptative du muscle squelettique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les mitochondries dépendent uniquement de l’expression et de la coordination des génomes nucléaire et mitochondrial pour leur synthèse et leur expansion dans les cellules. Cependant, le génome nucléaire code la grande majorité (99%) du protéome mitochondrial, ce qui souligne l’importance de la machinerie d’importation des protéines pour soutenir la biogenèse mitochondriale. L’importation sert également d’événement de signalisation important, car le défaut d’importation peut favoriser l’initiat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr G.C. Shore de l’Université McGill, le Dr A. Strauss de la Washington School of Medicine et le Dr .M.T. Ryan de l’Université La Trobe pour les dons originaux de plasmides d’expression qui ont été utilisés pour cette recherche. Ces travaux ont été soutenus par un financement du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) à D. A. Hood. D. A. Hood est également titulaire d’une chaire de recherche du Canada en physiologie cellulaire.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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