Medição da Capacidade de Importação de Proteínas das Mitocôndrias Musculares Esqueléticas

Summary

Mitocôndrias são organelas metabólicas chave que exibem um alto nível de plasticidade fenotípica no músculo esquelético. A importação de proteínas do citosol é um caminho crítico para a biogênese organela, essencial para a expansão do ritúlume e a manutenção da função mitocondrial. Portanto, a importação de proteínas serve como um barômetro da saúde celular.

Abstract

Mitocôndrias são organelas metabólicas e regulatórias fundamentais que determinam o fornecimento de energia, bem como a saúde geral da célula. No músculo esquelético, as mitocôndrias existem em uma série de morfologias complexas, que vão desde pequenas organelas ovais até uma rede ampla, semelhante a órticulo. Entender como o reticúrio mitocondrial se expande e se desenvolve em resposta a diversos estímulos, como alterações na demanda de energia, tem sido um tema de pesquisa há muito tempo. Um aspecto fundamental desse crescimento, ou biogênese, é a importação de proteínas precursoras, originalmente codificadas pelo genoma nuclear, sintetizadas no citosol, e translocadas em vários subcompartidários mitocondriais. Mitocôndrias desenvolveram um mecanismo sofisticado para este processo de importação, envolvendo muitos canais seletivos de membrana interna e externa, conhecidos como máquinas de importação de proteínas (PIM). A importação para a mitocôndria depende do potencial viável da membrana e da disponibilidade de ATP derivado de organela através da fosforilação oxidativa. Portanto, sua medição pode servir como medida de saúde organela. O PIM também exibe um alto nível de plasticidade adaptativa no músculo esquelético que é fortemente acoplado ao estado energético da célula. Por exemplo, o treinamento de exercícios tem sido mostrado para aumentar a capacidade de importação, enquanto o desuso muscular reduz,coincidentemente com mudanças nos marcadores de conteúdo mitocondrial. Embora a importação de proteínas seja um passo crítico na biogênese e expansão das mitocôndrias, o processo não é amplamente estudado no músculo esquelético. Assim, este artigo descreve como usar mitocôndrias isoladas e totalmente funcionais do músculo esquelético para medir a capacidade de importação de proteínas, a fim de promover uma maior compreensão dos métodos envolvidos e uma valorização da importância do caminho para a rotatividade de organelas no exercício, saúde e doenças.

Introduction

Mitocôndrias são organelas que existem em morfologias complexas em diferentes tipos celulares e são reconhecidas por possuir uma gama crescente de funções que são fundamentais para a saúde celular. Como tal, eles não podem mais ser reduzidos apenas a organelas produtoras de energia. Mitocôndrias são os principais reguladores metabólicos, determinantes do destino celular e centros de sinalização, das quais as funções podem servir como indicadores úteis da saúde celular geral. Nas células musculares esqueléticas, estudos de microscopia eletrônica revelam a presença de mitocôndrias subsarambimais geograficamente distintas (SS) e intermyofibrilar (FMI), que exibem um grau de conectividade1,2,3,4 que agora é reconhecida como altamente dinâmica e adaptável às mudanças nos níveis de atividade muscular esquelética, bem como com idade e doença. O conteúdo mitocondrial e a função muscular podem ser avaliados de inúmeras ^formas5,6, e métodos tradicionais de isolamento de organela têm sido aplicados para entender melhor as capacidades respiratórias e enzimáticas (Vmax) das mitocôndrias distintas da influência do meio ^celular7,8. Em particular, esses métodos tradicionais revelaram sutis distinções bioquímicas entre mitocôndrias isoladas das regiões subsarcolemmal e intermiofibrilar, desfaçando possíveis implicações funcionais para o metabolismo nessas regiões subcelulares8,9,10,11.

A biogênese das mitocôndrias é única em exigir a contribuição de produtos genéticos do DNA nuclear e mitocondrial. No entanto, a grande maioria deles são derivados do núcleo, uma vez que a transcrição do MTDNA só leva à síntese de 13 proteínas. Uma vez que as mitocôndrias normalmente compreendem >1000 proteínas envolvidas em diversas vias metabólicas, a biogênese da organela requer um meio bem regulado de importação e montagem de proteínas precursoras do citosol nos vários subcompartidores mitocondriais para manter a estequiometria e a função ^{adequadas12,13}. Proteínas codificadas por nuclear destinadas a mitocôndrias normalmente carregam uma sequência de alvo mitocondrial (MTS) que as visa à organela e facilita sua localização subcompartidária. A maioria das proteínas ligadas à matriz contém um MTS terminal N cleavável, enquanto aquelas destinadas à membrana mitocondrial externa ou interna geralmente têm domínios internos ^{de segmentação14}. O processo de importação é realizado por um conjunto de diversos canais que fornecem múltiplas vias para entrada na ^organela13. A translocase do complexo de membrana externa (TOM) transporta precursores do citosol para o espaço intermembrano, onde são reconhecidos pela translocase do complexo de membrana interna (TIM). Este complexo é responsável pela importação de precursores codificados nucleares para a matriz, onde os proteases cortam a preseqüência de alvo do terminal N. As proteínas destinadas à membrana externa podem ser diretamente inseridas nesta membrana através do complexo TOM, enquanto as destinadas à membrana interna são inseridas por uma proteína TIM, especificamente TIM22. Após sua importação, as proteínas são processadas por proteases residentes e acompanhantes e muitas vezes se combinam para formar complexos maiores, como os encontrados na cadeia de transporte de elétrons.

A importação de proteína mitocondrial também serve como uma medida da saúde mitocondrial, pois esse processo conta com a presença de potencial de membrana e uma fonte de energia na forma de ^ATP15. Por exemplo, quando o potencial da membrana é dissipado, a proteína quinase PINK1 não pode ser absorída pela organela, e isso leva a sinais de fosforilação que desencadeiam o início da degradação da organela através de uma via chamada ^{mitofagia16,17}. Em circunstâncias semelhantes, quando a importação é impedida, a proteína ATF5 não pode entrar na organela, e posteriormente se transloca para o núcleo, onde serve como fator de transcrição para a regulação da expressão genética ^UPR18,19. Assim, medir a eficiência de importação de proteínas pode fornecer uma visão abrangente da saúde da organela, enquanto a resposta à expressão genética pode ser usada para indicar o grau de sinalização retrógrada para o núcleo.

Apesar de sua óbvia importância para a biogênese das mitocôndrias e para a saúde celular em geral, a via de importação em mitocôndrias mamíferas é notavelmente subestudada. Neste relatório, descrevemos as etapas específicas envolvidas na medição da importação de proteínas precursoras em mitocôndrias musculares esqueléticas e fornecemos dados para ilustrar a resposta adaptativa do sistema de importação às alterações musculares e desuso, ilustrando a contribuição da importação de proteínas para a plasticidade adaptativa do músculo esquelético.

Protocol

Todos os animais usados nesses experimentos são mantidos na unidade de cuidados com animais da Universidade de York. Os experimentos são realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais com aprovação do Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de York (Licença: 2017-08). 1. Isolamento funcional das mitocôndrias subsarcolemmal e intermyofibrilar do músculo esquelético Preparação do reagente: Prepare todos os buffers e mídia…

Representative Results

Ilustramos extensivamente que este protocolo é um ensaio válido para determinar a taxa de importação em mitocôndrias musculares esqueléticas funcionais e intactas. Em comparação com as condições não tratadas, a importação de proteínas precursoras típicas como o malate desidrogenase (MDH) para a matriz é sensível ao potencial da membrana porque pode ser inibida pela valinomicina, um desacoplador da cadeia respiratória (Figura 2A). A importação também é i…

Discussion

Mitocôndrias são exclusivamente dependentes da expressão e coordenação dos genomas nuclear e mitocondrial para sua síntese e expansão dentro das células. No entanto, o genoma nuclear codifica a grande maioria (99%) do proteome mitocondrial, e isso ressalta a importância do maquinário de importação de proteínas no suporte à biogênese mitocondrial. A importação também serve como um importante evento de sinalização, pois a falta de importação pode promover o início da resposta proteica desdobrada e/ou…

Materials

0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	–	–	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	–	–	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	–	–	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML