طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران باستمرار
Summary
المعيار الذهبي في أمراض القلب للتجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية هي خلايا عضلة القلب. توضح هذه المقالة التكيفات مع تقنية غير Langendorff لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران.
Abstract
إن الحاجة إلى طرق قابلة للتكرار ولكنها بسيطة تقنيا تنتج خلايا عضلية قلبية عالية الجودة أمر ضروري للبحث في بيولوجيا القلب. التجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية (على سبيل المثال ، الانكماش ، الفيزيولوجيا الكهربية ، دورة الكالسيوم ، إلخ) على خلايا عضلة القلب هي المعيار الذهبي لإنشاء آلية (آليات) المرض. الفأر هو النوع المفضل للتجارب الوظيفية والتقنية الموصوفة مخصصة لعزل خلايا عضلة القلب في الفأر. تتطلب الطرق السابقة التي تتطلب جهاز Langendorff مستويات عالية من التدريب والدقة لقنية الأبهر ، مما يؤدي غالبا إلى نقص التروية. يتحول المجال نحو طرق عزل خالية من Langendorff بسيطة وقابلة للتكرار وتنتج خلايا عضلية قابلة للحياة للحصول على البيانات الفسيولوجية والثقافة. تقلل هذه الطرق بشكل كبير من وقت نقص التروية مقارنة بقنية الأبهر وتؤدي إلى خلايا عضلة القلب التي يتم الحصول عليها بشكل موثوق. يتضمن تكيفنا مع طريقة Langendorff-free التروية الأولية بمحلول إزالة الثلج البارد ، واستخدام منصة تثبيت تضمن إبرة ثابتة أثناء التروية ، وخطوات هضم إضافية لضمان الحصول على خلايا عضلة القلب بشكل موثوق لاستخدامها في القياسات الوظيفية والثقافة. هذه الطريقة بسيطة وسريعة الأداء وتتطلب القليل من المهارة الفنية.
Introduction
لعقود من الزمان ، كانت الفكرة الأساسية في أدبيات بيولوجيا القلب هي الآلية الجزيئية للعمل. يجب إنشاء آلية العمل من أجل نشر دراسات موثوقة. هناك استراتيجية راسخة لتحديد الآلية الجزيئية وهي دراسات خلايا عضلة القلب المعزولة ، والتي تتطلب خلايا عضلية قلبية عالية الجودة لتحقيق بيانات موثوقة. التجارب الخلوية والجزيئية التي أجريت على خلايا عضلة القلب لتحديد آلية العمل هي المعيار الذهبي للتحقيق في الانكماش1 ، الفيزيولوجيا الكهربية2 ، الكالسيوم (Ca 2+) ركوب الدراجات3 ، الشعيرات العضلية حساسية الكالسيوم2+ 4 ، الهيكل الخلوي5 ، التمثيل الغذائي6 ، تأثيرات الهرمونات7 ، جزيئات الإشارة8 ، دراسات الأدوية9 الخ. أصبح الفأر هو النوع المفضل لمعظم تجارب بيولوجيا القلب نظرا لسهولة التلاعب الجيني ، وصغر حجمه ، وعمره القصير نسبيا ، وتكلفته المنخفضة ، وما إلى ذلك10. ومع ذلك ، فإن العزلة الموثوقة لخلايا عضلة القلب عالية الجودة للفأر ليست تافهة مع التقنيات الحالية.
تقوم المختبرات بعزل خلايا عضلة القلب منذ ما يقرب من 70 عاما11. تعتمد جميع تقنيات عزل خلايا عضلة القلب تقريبا على هضم القلب عبر إنزيمات مختلفة (كولاجيناز ، بروتياز ، تربسين ، إلخ). في الفترات المبكرة (خمسينيات القرن العشرين-ستينيات القرن العشرين) ، تم استخدام طريقة قطعة ، والتي تضمنت إزالة القلب ، وقطع إلى قطع أصغر بكثير واحتضان في محلول مع كولاجيناز / بروتياز / تربسين12. في سبعينيات القرن العشرين نفذت مختبرات “Langendorff” المحسن طريقة13 ، والتي عزل خلايا عضلة القلب باستخدام تقنية العزل القائمة على نضح الشريان التاجي (التروية الرجعية مع الإنزيم عبر جهاز Langendorff) ؛ لا تزال هذه التقنية هي الطريقة السائدة لعزل الخلايا العضلية في الحقل اليوم ، ~ بعد 50 عاما14،15،16. تحول العمل الأخير إلى تقليب القلب في الجسم الحي للحد من وقت نقص الأكسجة والضرر الإقفاري مما أدى إلى عزلة فائقة لعضلة القلب (غلة أفضل وجودة أعلى)17. في الآونة الأخيرة ، تطور هذا إلى أداء في الجسم الحي ، نضح القلب الخالي من لانجيندورف18،19،20،21،22. لقد طورنا تقنية عزل خلايا عضلة القلب الخالية من Langendorff بناء على تقنية Ackers-Johnson et al.18 وقمنا بتكييف مكونات مختلفة من العديد من تقنيات العزل السابقة. تشمل هذه التعديلات الرئيسية حقن مخزن مؤقت لإزالة الجليد البارد ودمج منصة داعمة لتثبيت الإبرة ، مما يسمح بتقليل التلاعب بالقلب. كما تم تفصيل هذه التقنية التحكم في درجة حرارة المخازن المؤقتة المحقونة (37 درجة مئوية) ، مما قلل من الوقت بين الحقن في الجسم الحي والهضم بسبب قلة تروية EDTA كما تم نشرهسابقا 18. عن طريق تقليل التلاعب بالقلب وبالتالي تقليل حجم موقع البزل ، يتم الحصول على نضح شامل ومستمر للشرايين التاجية. قمنا أيضا بتحسين التقنية باستخدام طريقة هضم قطعة ثانوية ، وكمية EDTA في المخزن المؤقت للتطهير المحقون ، وتغيير درجة الحموضة. تقنيتنا الموصوفة أكثر موثوقية وأكثر كفاءة ولا تتطلب تدريبا / ممارسة مكثفة مقارنة باستخدام جهاز Langendorff (الجدول 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
الميزة الرئيسية لتقنية عزل خلايا عضلة القلب الخالية من Langendorff هي أنها تحد من نقص الأكسجة ووقت نقص تروية الدم من خلال عدم الحاجة إلى قنية لجهاز Langendorff. بدلا من تقنيات Langendorff الكلاسيكية التي تستغرق عدة دقائق لإزالة القلب وتنظيفه وتعليقه ، مما يؤدي غالبا إلى تلف نقص تروية الخلية العضلية ، تتضم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لمنح الصحة R01 HL114940 (Biesiadecki) و R01 AG060542 (Ziolo) و T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).
Materials
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3′-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
