Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo
Summary
Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.
Abstract
La necessità di metodi riproducibili ma tecnicamente semplici che producano cardiomiociti di alta qualità è essenziale per la ricerca in biologia cardiaca. Gli esperimenti funzionali cellulari e molecolari (ad esempio, contrazione, elettrofisiologia, ciclo del calcio, ecc.) sui cardiomiociti sono il gold standard per stabilire i meccanismi della malattia. Il topo è la specie di scelta per gli esperimenti funzionali e la tecnica descritta è specifica per l’isolamento dei cardiomiociti del topo. I metodi precedenti che richiedevano un apparato Langendorff richiedono alti livelli di allenamento e precisione per l’incannulamento aortico, spesso con conseguente ischemia. Il campo si sta spostando verso metodi di isolamento privi di Langendorff che sono semplici, sono riproducibili e producono miociti vitali per l’acquisizione e la coltura di dati fisiologici. Questi metodi riducono notevolmente il tempo di ischemia rispetto all’incannulamento aortico e si traducono in cardiomiociti ottenuti in modo affidabile. Il nostro adattamento al metodo Langendorff-free include una perfusione iniziale con soluzione di pulizia ghiacciata, l’uso di una piattaforma stabilizzante che garantisce un ago stabile durante la perfusione e ulteriori fasi di digestione per garantire cardiomiociti ottenuti in modo affidabile per l’uso in misurazioni funzionali e coltura. Questo metodo è semplice e veloce da eseguire e richiede poca abilità tecnica.
Introduction
Per decenni, un’idea essenziale nella letteratura di biologia cardiaca è il meccanismo molecolare d’azione. Il meccanismo d’azione deve essere stabilito al fine di pubblicare studi affidabili. Una strategia consolidata per determinare il meccanismo molecolare sono gli studi isolati sui cardiomiociti, che richiedono cardiomiociti di alta qualità per ottenere dati affidabili. Gli esperimenti cellulari e molecolari eseguiti sui cardiomiociti per determinare il meccanismo d’azione sono il gold standard per studiare la contrazione1, l’elettrofisiologia2, il calcio (Ca 2+) il ciclo3, il miofilamento Ca 2+ la sensibilità4, il citoscheletro 5, il metabolismo 6, gli effetti degli ormoni7, le molecole di segnalazione8, gli studi farmacologici9 and so on. Il topo è diventato la specie di scelta per la maggior parte degli esperimenti di biologia cardiaca a causa della facilità di manipolazione genetica, delle sue piccole dimensioni, della sua durata relativamente breve, del basso costo, ecc10. Tuttavia, l’isolamento affidabile dei cardiomiociti di topo di alta qualità non è banale con le tecniche attuali.
I laboratori hanno isolato cardiomiociti per quasi 70 anni11. Praticamente tutte le tecniche per isolare i cardiomiociti si basano sulla digestione del cuore attraverso vari enzimi (collagenasi, proteasi, tripsina, ecc.). Nei primi periodi (1950-1960), è stato impiegato il metodo del pezzo, che prevedeva la rimozione del cuore, il taglio in pezzi molto più piccoli e l’incubazione in soluzione con collagenasi / proteasi / tripsina12. Nel 1970 i laboratori implementarono il metodo migliorato “Langendorff”13, che isolava i cardiomiociti usando una tecnica di isolamento basata sulla perfusione coronarica (perfusione retrograda con enzima attraverso l’apparato di Langendorff); Questa tecnica rimane il metodo dominante di isolamento dei miociti nel campo oggi, ~ 50 anni dopo14,15,16. Recenti lavori si sono spostati sull’incannulamento del cuore in vivo per limitare il tempo di ipossia e il danno ischemico con conseguente isolamento cardiomiocitario superiore (rese migliori e qualità superiore)17. Recentemente, questo si è evoluto nell’esecuzione in vivo, perfusioni cardiache prive di Langendorff 18,19,20,21,22. Abbiamo sviluppato la tecnica di isolamento dei cardiomiociti liberi da Langendorff basata sulla tecnica Ackers-Johnson et al.18 e adattato vari componenti dalle molte tecniche di isolamento precedenti. Questi adattamenti chiave includono l’iniezione di un tampone di compensazione ghiacciato e l’incorporazione di una piattaforma di supporto per stabilizzare l’ago, consentendo una riduzione della manipolazione del cuore. Anche dettagliato in questa tecnica è il controllo della temperatura dei tamponi iniettati (37 °C), che ha ridotto il tempo tra l’iniezione in vivo e la digestione a causa della minore perfusione EDTA come precedentemente pubblicato18. Diminuendo la manipolazione del cuore e quindi riducendo al minimo le dimensioni del sito di puntura, si ottiene una perfusione completa e costante delle arterie coronarie. Abbiamo anche perfezionato la tecnica con un metodo di digestione secondario a pezzi, la quantità di EDTA nel tampone di compensazione iniettato e cambiato il pH. La nostra tecnica descritta è più affidabile, più efficiente e non richiede l’addestramento / pratica estensiva rispetto all’uso dell’apparato Langendorff (Tabella 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il vantaggio principale della nostra tecnica di isolamento cardiomiocitario senza Langendorff è che limita l’ipossia e il tempo ischemico non richiedendo l’incannulamento a un apparato Langendorff. In alternativa alle classiche tecniche Langendorff che richiedono diversi minuti per rimuovere, pulire e appendere il cuore, spesso con conseguente danno ischemico al miocita, il nostro metodo include una pulizia del sangue in vivo tramite una soluzione di pulizia ghiacciata. Il tampone di compensazione ghia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) e T32 HL134616 (Sturgill e Salyer).
Materials
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
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