Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón
Summary
El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.
Abstract
La necesidad de métodos reproducibles pero técnicamente simples que produzcan cardiomiocitos de alta calidad es esencial para la investigación en biología cardíaca. Los experimentos funcionales celulares y moleculares (por ejemplo, contracción, electrofisiología, ciclo de calcio, etc.) en cardiomiocitos son el estándar de oro para establecer los mecanismos de la enfermedad. El ratón es la especie de elección para experimentos funcionales y la técnica descrita es específicamente para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón. Los métodos anteriores que requerían un aparato de Langendorff requieren altos niveles de entrenamiento y precisión para la canulación aórtica, lo que a menudo resulta en isquemia. El campo se está desplazando hacia métodos de aislamiento sin Langendorff que son simples, son reproducibles y producen miocitos viables para la adquisición de datos fisiológicos y el cultivo. Estos métodos disminuyen en gran medida el tiempo de isquemia en comparación con la canulación aórtica y dan como resultado cardiomiocitos obtenidos de manera confiable. Nuestra adaptación al método sin Langendorff incluye una perfusión inicial con solución de limpieza helada, el uso de una plataforma estabilizadora que garantiza una aguja estable durante la perfusión y pasos de digestión adicionales para garantizar la obtención confiable de cardiomiocitos para su uso en mediciones funcionales y cultivo. Este método es simple y rápido de realizar y requiere poca habilidad técnica.
Introduction
Durante décadas, una idea esencial en la literatura de biología cardíaca es el mecanismo de acción molecular. El mecanismo de acción debe establecerse para publicar estudios confiables. Una estrategia bien establecida para determinar el mecanismo molecular son los estudios aislados de cardiomiocitos, que requieren cardiomiocitos de alta calidad para obtener datos confiables. Los experimentos celulares y moleculares realizados en cardiomiocitos para determinar el mecanismo de acción son el estándar de oro para investigar la contracción1, electrofisiología2, calcio (Ca 2+) ciclo3, miofilamento Ca2+ sensibilidad4, citoesqueleto5, metabolismo6, efectos de las hormonas7, moléculas de señalización8, estudios farmacológicos9 etc. El ratón se ha convertido en la especie de elección para la mayoría de los experimentos de biología cardíaca debido a la facilidad de manipulación genética, su pequeño tamaño, su vida útil relativamente corta, bajo costo, etc.10. Sin embargo, el aislamiento confiable de cardiomiocitos de ratón de alta calidad no es trivial con las técnicas actuales.
Los laboratorios han estado aislando cardiomiocitos durante casi 70 años11. Prácticamente todas las técnicas para aislar cardiomiocitos se basan en la digestión del corazón a través de varias enzimas (colagenasa, proteasa, tripsina, etc.). En los primeros períodos (1950-1960), se empleó el método de trozos, que consistía en extraer el corazón, cortar en trozos mucho más pequeños e incubar en solución con colagenasa / proteasa / tripsina12. En la década de 1970, los laboratorios implementaron el método mejorado “Langendorff”13, que aisló cardiomiocitos utilizando una técnica de aislamiento basada en la perfusión de la arteria coronaria (perfusión retrógrada con enzima a través del aparato de Langendorff); Esta técnica sigue siendo el método dominante de aislamiento de miocitos en el campo hoy en día, ~ 50 años después14,15,16. El trabajo reciente se ha desplazado a la canulación del corazón in vivo para limitar el tiempo de hipoxia y el daño isquémico, lo que resulta en aislamientos de cardiomiocitos superiores (mejores rendimientos y mayor calidad)17. Recientemente, esto ha evolucionado para realizar perfusiones cardíacas in vivo sin Langendorff 18,19,20,21,22. Hemos evolucionado la técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff basada en la técnica de Ackers-Johnson et al.18 y hemos adaptado varios componentes de las muchas técnicas de aislamiento anteriores. Estas adaptaciones clave incluyen la inyección de un tampón de limpieza helada y la incorporación de una plataforma de soporte para estabilizar la aguja, lo que permite una menor manipulación del corazón. También se detalla en esta técnica el control de la temperatura de los tampones inyectados (37 °C), lo que disminuyó el tiempo entre la inyección in vivo y la digestión debido a una menor perfusión de EDTA como se publicó anteriormente18. Al disminuir la manipulación del corazón y, por lo tanto, minimizar el tamaño del sitio de punción, se obtiene una perfusión completa y constante de las arterias coronarias. También refinamos la técnica con un método secundario de digestión de trozos, la cantidad de EDTA en el tampón de limpieza inyectado y cambiamos el pH. Nuestra técnica descrita es más confiable, más eficiente y no requiere el entrenamiento / práctica extensiva en comparación con el uso del aparato de Langendorff (Tabla 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La principal ventaja de nuestra técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff es que limita la hipoxia y el tiempo isquémico al no requerir canulación a un aparato de Langendorff. Alternativamente a las técnicas clásicas de Langendorff que tardan varios minutos en extraer, limpiar y colgar el corazón, lo que a menudo resulta en daño isquémico al miocito, nuestro método incluye una limpieza in vivo de la sangre a través de una solución de limpieza helada. El tampón de limpieza hela…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) y T32 HL134616 (Sturgill y Salyer) de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
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