Summary
在这里,我们描述了一种涉及荧光素酶和绿色荧光蛋白在各种乳腺癌细胞系中表达的非侵入性监测方法。该协议提供了一种在小鼠中实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。
Abstract
乳腺癌是一种常见的异质性恶性肿瘤,也是女性死亡的第二大原因,主要是由于远处的器官转移。已经产生了几种动物模型,包括广泛使用的原位小鼠模型,其中癌细胞被注射到乳腺脂肪垫中。然而,这些模型不能帮助监测肿瘤生长动力学和转移定植。在小鼠中实时监测癌细胞的尖端工具将显着促进对肿瘤生物学的理解。
在这里,建立了稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)的乳腺癌细胞系。具体而言,该技术包含两个连续的步骤,通过在 体外 测量荧光素酶活性而启动,然后将癌细胞植入非肥胖严重联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠的乳腺脂肪垫中。注射后,通过无创生物发光成像系统实时监测肿瘤生长和转移定植。然后,通过荧光显微镜检查肺部表达GFP转移的定量,以验证观察到的生物发光结果。这种复杂的系统结合了荧光素酶和基于荧光的检测工具,可评估体内的癌症转移 , 这在乳腺癌治疗和疾病管理中具有巨大的应用潜力。
Introduction
乳腺癌是全世界常见的癌症类型,美国每年诊断出约250,000例新病例1。尽管发病率很高,但一套新的抗癌药物显着改善了乳腺癌患者的预后2。然而,这些治疗仍然不足,因为许多患者经历疾病复发和转移扩散到重要器官2,这是患者发病和死亡的主要原因。因此,乳腺癌研究的主要挑战之一是确定调节远端转移形成的分子机制,以开发抑制其发展的新方法。
癌症转移是一个动态过程,其中细胞从原发肿瘤中分离并通过血液循环侵入邻近组织。因此,其中细胞经历类似转移级联反应的动物模型可以促进识别控制该过程的机制3,4。此外,这些 体内 模型对于开发乳腺癌治疗剂5,6是必不可少的。然而,这些原位模型不能指示实际的肿瘤生长动力学,因为效果仅在终止时确定。因此,我们建立了一种基于荧光素酶的工具,以实时检测肿瘤发展和转移定植。此外,这些细胞表达GFP以检测转移集落。这种方法相对简单,不涉及任何侵入性操作3。因此,结合荧光素酶和荧光检测是推进乳腺癌治疗和疾病管理的临床前研究的有用策略。
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Protocol
所有小鼠实验均在希伯来大学机构动物护理和使用委员会批准的协议MD-21-16429-5下进行。此外,希伯来大学还获得了实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的认证。
1. 细胞系维持
注意:本方案中使用了人乳腺癌细胞系(MCF-7,MDA-MB-468和MDA-MB-231)。
- 在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中培养所有乳腺癌细胞系,并在37°C下在加湿的二氧化碳(5%CO 2)培养箱中补充10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素 - 链霉素。
注意:定期检查细胞密度;拆分并扩展,以便在它们达到 70% 汇合度时将来使用。
2. 病毒制备
- 用1毫升胰蛋白酶处理HEK293T细胞,直到它们分离。
- 加入10mL DMEM(10%FBS)以中和胰蛋白酶活性,并将细胞悬浮液转移到新的15mL离心管中。
- 以150× g 离心5分钟以沉淀细胞。离心后弃去上清液,加入1mL新鲜DMEM培养基。
- 测定细胞浓度,并在六孔板中×106 个细胞/孔中接种1.2个细胞。
- 第二天,预热所有必需的试剂,包括转染试剂、无血清 DMEM、包膜质粒 (VSV-G)、慢病毒包装质粒 (ΔVPR) 和 pLX304 荧光素酶-V5 原始质粒或 FUW GFP 质粒。
- 在1.5mL高压灭菌离心管中,将50μL无血清DMEM与0.3μgVSV-G质粒,1μgΔVPR和1.2μgp304荧光素酶-V5原始质粒或FUW GFP质粒混合。
- 将这些质粒与培养基充分混合后,加入5μL转染试剂,轻轻混合,并将混合物在室温下孵育15分钟。
- 孵育后,将混合物滴加到HEK293T细胞中。
- 24小时后,用2mL(30%FBS)DMEM替换生长培养基。第二天(转染后48小时),收获含有病毒的培养基(“pLX304荧光素酶-V5或FUW GFP病毒”)。
注意:使用30%的FBS可提高病毒生产效率。 - 为避免任何HEK293T细胞残留物,将含病毒的培养基通过0.45μm注射器过滤器或以150× g 离心5分钟,并收集上清液。
注意:对于长期储存,请将病毒的工作等分试样保持在-80°C。
3. 建立稳定表达GFP和荧光素酶的细胞(“GFP + Luc+ 细胞”)
- 在感染细胞的前一天,在六孔板中每孔接种8×10 5 个细胞。
- 过夜孵育后,用含有8μg/ mL聚苯乙烯的新鲜培养基替换生长培养基。向细胞中滴加200μLFUGFP病毒。
- 可选:为了提高病毒效率,将板以560× g 离心30分钟(37°C)(旋转感染)。
- 将细胞孵育48小时,并通过荧光显微镜验证GFP表达。
- 通过荧光活化细胞分选(FACS)(GFP +)对表达GFP的细胞进行分类(图1A)。
- 如步骤3.2所述,用pLX304荧光素酶-V5原始病毒感染GFP分选的细胞。
- 感染后30小时用杀卵杆菌素(10μg/ mL)处理细胞,以富集pLX304荧光素酶-V5原始细胞表达细胞(GFP +,Luc + 细胞)。然后,每两天,用含有杀菌素的新鲜培养基替换。此外,作为对照,用相同的含杀菌素的培养基处理幼稚细胞。
注意:在喷枪鱼苷治疗几天后,应观察到感染细胞和对照细胞之间的明显差异。这种效果是细胞系依赖性的,通常需要约8-10天。存活率低表明病毒产量低。如果是这样,产生新一批病毒,因为低效率可能会影响未来的实验。
4. 验证 体外 荧光素酶活性
- 在15厘米的平板中生长MCF-7,MDA-MB-468和MDA-MB-231 GFP + Luc + 细胞至80%汇合。通过胰蛋白酶消化收获细胞,如步骤2.1-2.2中所述。
- 将每个孔中越来越多的细胞(0.1,0.5,1,2,3,4×104)接种到黑色96孔板中。
注意:黑色96孔板更适合测量荧光素酶水平,因为白色或透明板会产生自发光信号。作为对照,在一个孔中单独使用磷酸盐缓冲盐水(PBS),以确保PBS没有自发光。 - 用100μLDMEM填充所有孔并孵育16-24小时。
- 从30mg / mL的储备中以1.5mg / mL浓度制备PBS中的荧光素溶液。等分荧光素溶液的储备并储存在-20°C。
- 用PBS轻轻洗涤细胞一次,向每个孔中加入100μL荧光素溶液,等待2分钟。最后,使用生物发光测量所有乳腺癌细胞中的荧光素酶活性。
注意:在动物实验之前检查 体外 GFP和荧光素酶表达至关重要。此外,空白孔用于减去背景。
5. 给小鼠注射GFP+ Luc+ 细胞
- 将5×106 (MCF-7和MDA-MB-468)或2×106 (MDA-MB-231)GFP+ Luc+ 细胞分别转移到200μL或100μL PBS中。
- 注射前,用5%消毒剂溶液清洁无菌生物罩(见 材料表)。然后,用过滤的(0.2μm)含有4%异氟醚的空气以1 L / min的气流速率麻醉小鼠2-3分钟。
注意:必须确认适当的麻醉;捏住鼠标的脚趾,寻找任何反应。 - 以仰卧姿势在麻醉的鼠标头上放置一个锥体。将兽医软膏涂抹在眼睛上,以防止麻醉时干燥。
- 用棉签用乙醇擦拭小鼠的腹部区域,在乳腺上方,并用镊子抬起第 4个乳腺。
- 将针头27 G x 3/4(0.4 x 19 mm)插入脂肪垫下,然后缓慢注射100μL细胞悬浮液。
注意:皮肤下方将出现圆形凸起。此外,注射不当可能导致肿瘤生长速率的偏差或同一实验组中肿瘤的缺失。 - 注射程序后,将小鼠从罩中取出并将其转移到新的笼子中。监测小鼠,直到它们恢复意识。
注意:确保所有用过的针头和注射器都丢弃在利器盒中。
6. 测量GFP+ Luc+ 小鼠中的荧光素酶水平
- 在生物发光检测之前,用左手握住有意识的小鼠脖子来抑制有意识的小鼠。然后,将手向左倾斜,使鼠标正面朝上,下半身处于仰卧位置。
- 使用针头尺寸为27 G x 3/4(0.4 x 19 mm)的1.0mL注射器,腹膜内注射100μL荧光素(30mg / mL)腹膜内(ip)到左下腹象限的小鼠腹面。
注意:针尖不应插入距离腹壁超过3-5毫米,因为它可能穿透内脏器官。此外,建议在没有麻醉的情况下进行ip注射,因为荧光素在麻醉小鼠体内的分布比有意识的小鼠慢。因此,监测有意识的小鼠中的荧光素酶水平是一种更快的过程。 - 在没有麻醉的情况下将小鼠保持7分钟,然后在麻醉室内保持3分钟,然后测量肿瘤动力学。
注意:孵育时间因不同实验、细胞系和物种而异。因此,建议在开始实验之前校准孵育时间。 - 按照步骤5.2-5.3中描述的麻醉小鼠。
- 在孵育过程中打开软件(材料表),初始化成像系统,然后单击“ 初始化 ”按钮。
注意:请注意,相机需要大约10分钟才能冷却并达到-90°C。 此外,作为背景对照,测量幼鼠(即注射 了不表达荧光素酶基因的细胞的GFP + 小鼠)中的荧光素酶水平。 - 使用以下设置将设置保持在自动曝光状态:曝光时间自动,60秒;分档介质,F/停止 1;励磁滤波器堵塞;发射滤光片打开。 初始化 结束后,选择“ 映像向导”|生物发光 ,然后单击“ 下一步|打开“筛选器 |在图像主体中选择 鼠标 。
- 在 “视场”中,选择舞台 C(10 厘米)和 拍摄对象高度:1.50 厘米。
- 单击“ 图像设置舞台 ”到 C,在单击“ 采集 ”按钮之前,请确保将鼠标放置在舞台上正确的仰卧位置。
- 关闭门,单击“ 获取 ”按钮,然后等待屏幕上显示图像。
注意:使用 自动曝光 选项,强信号需要5-20秒,具体取决于信号;微弱的信号大约需要60秒。 - 对其他鼠标重复此步骤。
- 为了检测肺转移,请使用厚厚的黑色纸板纸覆盖原发性肿瘤的强信号,并且仅将肺部的腹侧朝向相机暴露。使用上述相同参数捕获图像。
7. 使用生物发光和荧光获取 离体 图像
- 在干燥器中使用二氧化碳(CO2)吸入对小鼠实施安乐死,并使用高压灭菌的剪刀和镊子解剖小鼠。
- 使用0.9%盐水灌注小鼠,收获器官,并用1x PBS冲洗以消除器官中的血迹。
- 将冲洗的器官转移到培养皿中,并将其放入生物发光机的阶段。应用步骤6.2-6.6中所述的相同生物发光设置。
注意:由于荧光素酶信号的减少,此步骤是有时间限制的。因此,在对小鼠实施安乐死后,立即通过生物发光可视化器官。 - 对于GFP图像,应用与步骤6.3中所述相同的设置,使用 荧光GFP滤光片 代替 生物发光。
- 使用体视显微镜拍摄肺部图像以检查GFP + 菌落的存在。
8. 生物发光数据分析
- 双击该软件,然后从“文件”菜单中选择“打开”。
- 打开所有文件并将其最小化。确保所有单位均为 辐射度(光子)。此外,单击“ 全部应用 ”以为所有图像保留相同的参数。
- 从“ 视图 ”菜单中,选择“ 工具选项板”,这将打开一个新窗口。
- 从 “工具选项板” 窗口中,选择“ ROI 工具 ”选项卡,然后在 “类型”中选择“ Bkg 平均 ROI”。
- 从 ROI 工具中,选择“ 圆”,然后在鼠标的胸部区域绘制一个小圆圈。
- 双击圆圈,从“后台 ROI”选项卡中选择“用作 BKG 以供将来的 ROI”选项,然后单击“完成”。
9. 测量总通量
- 从 “工具选项板 ”窗口中,选择“ ROI 工具 ”选项卡,然后在 “类型”中选择 “ROI 的度量”。
- 从 ROI工具中,选择 “圆圈”,然后在鼠标的原发肿瘤上绘制一个大圆圈。
- 右键单击“ 复制 ROI ”,然后右键单击“ 将 ROI 粘贴 到每个鼠标的每个单独文件中”。
- 单击 ROI 工具选项卡中的“测量 ROI”,这将打开一个名为“ROI 度量”的新窗口。在此选项卡中,将“测量类型”保留为“辐射度(光子)”,将“图像属性”保留为“所有填充值”。
- 将文件导出为 测量文件 (*.txt) 或 Csv (*.csv) 格式。
- 在电子表格中打开导出的数据,并获取 总通量 (p/s) 和周的值。
注意:此步骤可用于测量不同的组。例如,用载体治疗的小鼠与用药物治疗的小鼠。 - 生成 XY 图,其中 时间 沿 X 轴显示, 总通量 (p/s) 沿 Y 轴显示。对于每周,获取每个样本组 的总通量 (p/s) 参数,并使用非参数学生 t 检验确定任何显著差异。
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Representative Results
我们生成了表达GFP和荧光素酶载体的乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,MCF-7和MDA-MB-468)。具体来说,这是通过顺序感染实现的。首先,乳腺癌细胞系感染了表达荧光GFP的慢病毒载体。GFP阳性细胞(GFP+)在感染后2天进行分类(图1A,B)并感染pLX304荧光素酶-V5载体。然后,使用杀菌素选择荧光素酶以产生指示的(GFP +,Luc +)细胞。为了验证 体外 荧光素酶活性,我们证明了荧光素酶活性水平的细胞数量依赖性增加(图1C)。此外,发现荧光素酶活性与细胞数量之间存在线性相关性(图1D)。
为了确认小鼠中荧光素酶的检测,将三种GFP+,Luc+ 乳腺癌细胞系全部注射到雌性NOD / SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。然后,每两周对小鼠进行一次生物发光读数,以确定肿瘤生长动力学。我们发现肿瘤生长动力学在细胞系之间变化;在更具侵袭性的MDA-MB-231中更快,在侵袭性较弱的细胞系MCF-7和MDA-MB-468中速度较慢(图2)。
接下来,获得由MDA-MB-231细胞系产生的分离肿瘤的荧光读数。具体而言,注射后6周,从小鼠中收获肿瘤以确认GFP荧光;发现肿瘤维持其GFP表达(图3A)。下一个目标是确定是否可以使用生物发光机在活体小鼠的肺部实时评估转移集落形成;从整只小鼠的肺部获得阳性生物发光读数(图3B)。为了验证这些是阳性转移菌落,收获肺,并观察转移菌落的GFP和生物发光(图3C)。
图1:验证细胞中GFP表达和荧光素酶活性。 (A)GFP细胞通过FACS分类。MDA-MB-231非GFP和GFP +细胞的 代表性图像。(B)MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-468细胞感染了表达GFP的病毒,随后进行FACS分选。每个细胞系的图像以明场(左)和GFP(右)表示。这些细胞是在尼康Eclipse 80i显微镜下以10倍放大率捕获的。(C)每个细胞中荧光素酶活性引起的生物发光由光度计测定。越来越多的细胞(如 A)接种在黑色96孔板中。颜色条表示发光的强度。(D)XY图,显示MDA-MB-231细胞的荧光素酶活性(在 C中测量)。缩写:GFP =绿色荧光蛋白;SSC-A = 侧散射峰的面积;GFP+ = GFP阳性;FACS = 荧光激活的细胞分选。 请点击此处查看此图的大图。
图2:肿瘤生长的动力学由生物发光机测定。 每周在NOD-SCID小鼠体内测定肿瘤生长动力学,并使用生物发光捕获(A)MDA-MB-231,(B)MCF-7,(C)MDA-MB-468的代表性图像。颜色条表示发光的强度。(D)发光活性的定量表示为总通量。(E) MDA-MB-231小鼠;以情节表示的个人阅读。请点击此处查看此图的大图。
图3:验证肿瘤形成和肺转移的不同方法。 (A)对小鼠进行灌注,并收获MDA-MB-231细胞产生的肿瘤。肿瘤中的GFP水平由生物发光机测量。(B)整个小鼠的肺转移,如生物发光所示。(C)为了确认转移灶的存在,在SMZ18尼康立体显微镜(明场和GFP)下收获并观察肺部。在对小鼠实施安乐死后立即采集生物发光Luc样品。颜色条表示发光的强度。缩写:GFP =绿色荧光蛋白;吕克=荧光素酶;BLI = 生物发光成像。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
基于动物的实验是癌症研究的必要条件7,8,9,实际上已经开发了许多方案3,6,10,11,12,13,14。然而,这些研究中的大多数仅在实验结束时确定了生物学效应,因此对肿瘤生长动力学或转移定植的影响仍未确定。在这里,我们提供一种非侵入性双重生物发光方法,将表达GFP和荧光素酶的细胞接种到乳腺脂肪垫中。使用这种强大的工具,可以实时监测小鼠中的肿瘤发展和转移14。但是,此技术包含一些关键步骤,需要格外小心。例如,该实验成功的关键步骤之一是通过在小鼠注射前监测细胞中的荧光素酶和GFP表达水平来验证感染的效率。因此,应针对每个细胞系优化杀菌素剂量15 和慢病毒生产方案16 以提高实验效率。
一些技术问题可能会影响 体内 实验中的生物发光信号。这些问题包括小鼠在生物发光读数过程中的运动,这可能会干扰图像质量,从而影响肿瘤动力学曲线。因此,动物必须在底物注射后和整个过程中得到完全麻醉。此外,将多只动物同时放入机器中可能会导致发光读数不一致,因为具有高信号的小鼠可以掩盖强度较低的小鼠。因此,必须为每只小鼠单独获取发光读数。
在进行 体外 生物发光读取时,用PBS代替培养基至关重要,因为培养基含有可能干扰信号的血清和其他补充剂。此外,有必要通过测量仅含有PBS(无细胞)的样品的发光信号来消除背景读数。
该协议描述了一种测量乳腺癌细胞生长和转移的非侵入性技术。具体而言,本文描述了注射乳腺癌细胞系,将GFP和荧光素酶同时表达到小鼠乳腺脂肪垫中。这种组合为测量体内和离体转移定植提供了一种快速可靠的方法。
尽管这种方法具有明显的优点,但它有一些局限性。主要限制因素是需要生物发光机,因为这是一种相对昂贵的机器,因此并不总是可用。此外,每次读取都很耗时,因此机器可能会超额预订且不可用。另一个限制是指协议本身。为了检测 离体 样品中的生物发光信号,建议对小鼠实施安乐死并立即检查样品。此步骤是一个时间限制阶段,对于大量实验是不可行的。
总之,这种无创生物发光工具对检测小鼠肿瘤发展和转移高度敏感。该方案不仅限于乳腺癌,可应用于其他癌症,如肺癌和胰腺癌。此外,由于它是无创的,因此可以应用于实时测量抗癌药物12 的功效及其对肿瘤生长动力学的影响。
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Disclosures
所有作者都透露他们没有任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Y.D.S.实验室的成员。我们要感谢耶路撒冷哈达萨医学中心的Wohl转化医学研究所提供小动物成像设施。这项研究得到了以色列癌症研究基金会的研究 职业发展奖 的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
BD FACSAria III sorter | BD | ||
BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
PBS | Hylabs | BP655/500D | |
pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
Virusolve | disinfectant | ||
VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
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