Övervakning av bröstcancertillväxt och metastatisk kolonibildning hos möss med bioluminescens
Summary
Här beskriver vi en icke-invasiv övervakningsmetod som involverar luciferas och grönt fluorescerande proteinuttryck i olika bröstcancercellinjer. Detta protokoll ger en teknik för att övervaka tumörbildning och metastatisk kolonisering i realtid hos möss.
Abstract
Bröstcancer är en frekvent heterogen malignitet och den näst vanligaste orsaken till dödlighet hos kvinnor, främst på grund av avlägsna organmetastaser. Flera djurmodeller har genererats, inklusive de allmänt använda ortotopiska musmodellerna, där cancerceller injiceras i bröstfettkudden. Dessa modeller kan dock inte hjälpa till att övervaka tumörtillväxtkinetik och metastatisk kolonisering. Banbrytande verktyg för att övervaka cancerceller i realtid hos möss kommer avsevärt att främja förståelsen av tumörbiologi.
Här etablerades bröstcancercellinjer som stabilt uttrycker luciferas och grönt fluorescerande protein (GFP). Specifikt innehåller denna teknik två sekventiella steg som initieras genom att mäta luciferasaktiviteten in vitro och följt av implantation av cancercellerna i bröstfettkuddar av icke-obese diabetiker-svåra kombinerade immunbrist (NOD-SCID) möss. Efter injektionen övervakas både tumörtillväxten och metastatisk kolonisering i realtid av det icke-invasiva bioluminescensavbildningssystemet. Därefter kommer kvantifieringen av GFP-uttryckande metastaser i lungorna att undersökas med fluorescensmikroskopi för att validera de observerade bioluminescensresultaten. Detta sofistikerade system som kombinerar luciferas- och fluorescensbaserade detektionsverktyg utvärderar cancermetastaser in vivo, vilket har stor potential för användning i bröstcancerterapi och sjukdomshantering.
Introduction
Bröstcancer är vanliga typer av cancer över hela världen, med cirka 250 000 nya fall som diagnostiseras varje år i USA1. Trots sin höga förekomst har en ny uppsättning läkemedel mot cancer avsevärt förbättrat bröstcancerpatientens resultat2. Dessa behandlingar är dock fortfarande otillräckliga, eftersom många patienter upplever sjukdomsåterfall och metastatisk spridning till vitala organ2, vilket är den främsta orsaken till patientens sjuklighet och dödlighet. Därför är en av de största utmaningarna inom bröstcancerforskning att identifiera de molekylära mekanismer som reglerar bildandet av distala metastaser för att utveckla nya medel för att hämma deras utveckling.
Cancermetastaser är en dynamisk process där celler lossnar från den primära tumören och invaderar angränsande vävnader genom blodcirkulationen. Således kan djurmodeller där cellerna genomgår en liknande metastatisk kaskad underlätta identifieringen av de mekanismer som styr denna process 3,4. Dessutom är dessa in vivo-modeller viktiga för att utveckla terapeutiska medel för bröstcancer 5,6. Dessa ortotopiska modeller kan dock inte indikera den faktiska tumörtillväxtkinetiken eftersom effekten endast bestäms vid avslutning. Därför etablerade vi ett luciferasbaserat verktyg för att upptäcka tumörutveckling och metastatisk kolonisering i realtid. Dessutom uttrycker dessa celler GFP för att detektera de metastatiska kolonierna. Detta tillvägagångssätt är relativt enkelt och involverar inga invasiva förfaranden3. Att kombinera luciferas- och fluorescensdetektering är således en användbar strategi för att främja de prekliniska studierna av bröstcancerterapi och sjukdomshantering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Djurbaserade experiment är obligatoriska för cancerforskning 7,8,9, och faktiskt har många protokoll utvecklats 3,6,10,11,12,13,14. De flesta av dessa studier bestämde emellertid den biologiska …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Y.D.S.-laboratoriet. Vi vill tacka The Wohl Institute for Translational Medicine vid Hadassah Medical Center, Jerusalem, för att ha tillhandahållit den lilla djuravbildningsanläggningen. Denna studie stöddes av Research Career Development Award från Israel Cancer Research Fund.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
