TCID50 에세이를 사용하여 바이러스 성 적정에 대한 시각적 세포 병증 효과 기반 읽기를 개선하기 위해 크리스탈 바이올렛의 사용
Summary
이 프로토콜은 광학 현미경 검사법과 면역 세포화학 얼룩과 비교하여 크리스탈 바이올렛을 사용하여 바이러스 성도를 시각화하는 정확하고 객관적인 접근 방식을 보여줍니다.
Abstract
바이러스 성 적정은 바이러스 학 연구에 대 한 핵심 분석. TCID50 애세 및 플라크 형성 장치(PFU) 애법을 통한 세포요법 효과(CPE)의 검출은 바이러스 스톡의 티터를 계산하는 두 가지 주요 방법이며 종종 시각화를 위한 현미경 검사감지 또는 세포 염색에 기초한다. TCID50 분석의 경우, 객관적인 시각화는 일반적으로 현미경 을 통해 시각적 CPE 검출과 결합 된 티터를 계산하기 위해 세포 내 바이러스의 면역 세포 화학 (ICC) 염색에 기초한다. 그러나 ICC 염색은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 이 연구에서는, 우리는 현미경 검사법을 통해 시각적 CPE 관측을 비교, ICC 염색 및 크리스탈 보라색 얼룩 두 개의 CPE 형성 바이러스의 타이터를 결정하기 위해, 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 돼지 기원과 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV). 우리는 크리스탈 바이올렛과 ICC 염색이 모두 IAV와 PRRSV 모두에 정밀도의 거의 동일한 수준을 제시, 시각적 CPE 검출보다 더 정확하다는 것을 보여줍니다. 이러한 이유로, 여기에서 우리는 세포주에서 적정된 CPE 형성 바이러스에 대한 TCID50 분석법에 바이러스 적정을 결정하는 빠르고 더 저렴한 방법으로 크리스탈 보라색 염색을 제시합니다.
Introduction
TCID50 분석법을 통한 바이러스 적정은 전염병 연구에서 일반적으로 사용되는 기술입니다1. 이 방법의 뒤에 수학에 변이는 시간이 지남에 제안되었지만1,2,3,4, 감염 검출의 현재 적용 방법은 현미경을 사용하여 세포 요법 효과 (CPE)의 존재를 통해 시각적 확인에 의존5. TCID50 분석에서 CPE 시각화를 보다 객관적으로 확인하기 위해, 바이러스의 단백질을 표적으로 하는 면역 세포 화학(ICC) 세포내 염색은 다른 바이러스가 다양한 형태의 CPE를 생성할 수 있기 때문에 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다6. 우리의 경우에, 세포 형태학적 변화는 감염된 세포가 반올림하고 접시에서 분리하는 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)와 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)에 모두 감염될 때 유사합니다. PRRSV의 경우, 모든 세포가 우물에서 분리되는 “총 파괴”로 알려진 CPE를 일으킵니다. 한편, IAV는 감염 후 소수의 세포가 분리되지 않는 “서브토탈 파괴”로 알려진 총 파괴 및 추가 CPE를 둘 다 제시할 수 있다7. 그러나 이 기술은 수행하는 데 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비용이 많이 드는 시약을 사용해야 합니다. ICC는 CPE에 라벨을 붙이지 않고 바이러스에 성공적으로 감염된 세포의 수를 주목하는 것이 중요합니다. 이것은 감염이 아직 CPE를 일으키지 않더라도 인큐베이션의 끝에 의해 성공적으로 감염된 세포가 긍정적으로 보일 것이라는 점을 암시하고, 따라서, CPE에 비해 ICC 양성 세포의 더 높은 비율이 예상된다. 이러한 이유로, 본 연구에서는 TCID50 분석에서 CPE의 시각적 검출의 보완적인 방법을 설명합니다, 세포막에 부착하고 신봉세포를 얼룩에 사용하는 양전전을 가진 화학 물질인 결정 보라색을 기반으로 합니다. 크리스탈 바이올렛은 종종 플라크 형성 단위를 측정하기 위해 바이러스 학 연구에서 활용8.
이 연구에서는, 우리는 높은 감도로 인해 더 객관적인 것으로 알려져 있는 바이러스성 단백질 인식에 근거를 둔 결정 보라색 염색 및 면역 세포화학 염색과 비 염색한 현미경 CPE 검출의 감도를 비교합니다. 이 연구는 크리스탈 바이올렛과 면역 세포화학 염색이 시각적 현미경 기반 CPE 검출보다 더 정확하며 TCID50 적정에서 감염된 우물을 객관적으로 식별하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 세포주에서 테스트된 세포병증 바이러스에 대한 정확도의 거의 동일한 수준에 도달하는 능력을 감안할 때, 크리스탈 바이올렛은 TCID50 분석에서 바이러스 적정을 결정하는 빠르고 저렴한 방법으로 제시됩니다. 상기 크리스탈 바이올렛 스테인링을 이용한 제안된 방법은 총 40분 동안 수행되며, 파라포름알데히드(PFA) 인큐베이션은 15분, 크리스탈 바이올렛 인큐베이션은 5분, 재료 제제, 완충 세차 및 건조를 위해 최대 15분이 소요된다. 비교에 적용된 면역세포화학 프로토콜은 평균 4시간 30분소요되며, 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다9,10. 제안 된 방법은 완성 된 바이러스 성 적정을 시각화하는 것을 목표로합니다. 감염 및 잠복기는 바이러스에 따라 다른 레이아웃으로 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 세포주에 세포병증 효력을 가진 2개의 RNA 바이러스를 시험했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스 적 정수는 PFU 검출 및 TCID50 assays가장 일반적으로 사용되는 바이러스 학 연구에서 일상적으로 사용됩니다1,2,3,4. 두 방법 모두 감염된 세포에서 CPE의 검출에 의존하고, 현미경 검사를 통해 시각적으로 평가될 수 있더라도, 염색은 일반적으로 더 객관적인 결과를 얻거나 잠복시간을 감?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고에서 자신의 유용한 의견에 대한 박사 프랭크 슐레를 인정하고 싶습니다, 클로이 마리언트는 현미경 이미지와 그녀의 도움이 영어 개정에 대한 테레사 M. 티지그녀의 도움에 대한.
Materials
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
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