Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos
Summary
Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.
Abstract
La terapia individualizada para pacientes con fibrosis quística (FQ) se puede lograr con un modelo de enfermedad in vitro para comprender la actividad basal del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y la restauración a partir de compuestos de moléculas pequeñas. Nuestro grupo se centró recientemente en establecer un modelo organoide bien diferenciado derivado directamente de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE). La histología de organoides seccionados, la tinción inmunofluorescente de montaje completo y las imágenes (utilizando microscopía confocal, microscopía inmunofluorescente y campo brillante) son esenciales para caracterizar organoides y confirmar la diferenciación epitelial en preparación para ensayos funcionales. Además, los organoides HNE producen lúmenes de diferentes tamaños que se correlacionan con la actividad de CFTR, distinguiendo entre organoides CF y no CF. En este manuscrito, se describe en detalle la metodología para el cultivo de organoides HNE, centrándose en la evaluación de la diferenciación utilizando las modalidades de imagen, incluida la medición del área de lúmenes basales (un método de medición de la actividad CFTR en organoides que cualquier laboratorio con un microscopio puede emplear), así como el enfoque automatizado desarrollado para un ensayo funcional (que requiere equipos más especializados).
Introduction
Introducción a la técnica
Los ensayos basados en cultivos ex vivo son una herramienta cada vez más utilizada para la medicina de precisión y el estudio de la fisiopatología de enfermedades. El cultivo primario de células epiteliales nasales humanas (HNE) se ha utilizado en numerosos estudios de fibrosis quística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , una enfermedad autosómica recesiva que afecta la función de las células epiteliales en múltiples órganos. El cultivo de HNE proporciona una fuente renovable de epitelios de las vías respiratorias que se pueden obtener prospectivamente y recapitula las cualidades electrofisiológicas y bioquímicas para probar la actividad del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Las células HNE se pueden muestrear con efectos secundarios mínimos14, similar a los hisopos respiratorios virales comunes. Recientemente se ha publicado un trabajo de investigación que describe un modelo para el estudio de la fibrosis quística derivado de biopsias con cepillo HNE11,13. Si bien es similar a otros modelos que utilizan HNEprimaria 2,3 y tejido intestinal 15,16,17,18,19, la caracterización detallada de la diferenciación y la obtención de imágenes de este modelo se describen aquí para su uso en la investigación de la FQ y para ayudar en los estudios de otras enfermedades de las vías respiratorias 13 . El modelo organoide no es ilimitado como las líneas celulares inmortalizadas, sino que puede ampliarse mediante reprogramación condicional (utilizando fibroblastos alimentadores irradiados e inactivados e inhibidores de la Rho-quinasa) a un estado más similar al de las células madre 20,21,22,23. El procesamiento de biopsias con cepillo HNE utilizando este método produce un gran número de células epiteliales para su uso en múltiples aplicaciones con un mayor rendimiento, al tiempo que conserva la capacidad de diferenciarse completamente. Si bien este protocolo se desarrolló utilizando células alimentadoras, otros investigadores que deseen evitar la tecnología de células alimentadoraspueden utilizar otras metodologías 14,24.
Importancia de la técnica para la biología pulmonar
Se ha dedicado un estudio significativo a comprender cómo la ausencia de CFTR regular y funcional en la membrana celular de las células epiteliales resulta en una disfunción en los pulmones, el páncreas, el hígado, el intestino u otros tejidos. El transporte disfuncional de iones epiteliales, particularmente el de cloruro y bicarbonato, da como resultado una disminución del volumen de los fluidos del revestimiento epitelial y cambios en las secreciones mucosas, lo que lleva a la estasis mucosa y la obstrucción. En otras enfermedades de las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria, el movimiento ciliar alterado afecta el aclaramiento mucociliar y conduce a estasis mucosa y obstrucción25. Por lo tanto, el modelo organoide HNE actual se ha desarrollado para diversas aplicaciones, dependiendo del diseño experimental y los recursos del investigador. Esto incluye imágenes de células vivas utilizando tinciones de células vivas; fijación y seccionamiento para caracterizar la morfología; tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos e imágenes confocales de montaje completo para evitar la interrupción de las estructuras intraluminales; y imágenes de campo brillante y tomografía de coherencia microóptica para mediciones cuantitativas de la frecuencia de latido ciliar y el transporte mucociliar13. Para facilitar la expansión a otros investigadores, se utilizaron reactivos y suministros disponibles comercialmente para el cultivo. Se desarrolló un ensayo funcional que utilizó técnicas comunes de microscopio y equipos más especializados. En general, si bien el presente modelo fue diseñado para evaluar la actividad de CFTR al inicio o en respuesta a la terapéutica, las técnicas descritas en este protocolo se pueden aplicar a otras enfermedades que involucran la función de las células epiteliales, especialmente el transporte de líquido celular epitelial.
Comparación con otras metodologías
Recientemente se desarrolló la utilidad de este modelo organoide correlacionando in vitro las respuestas moduladoras CFTR de los organoides de los pacientes con su respuesta clínica11. En particular, también se demuestra que el modelo actual era paralelo a las respuestas de corriente de cortocircuito, el estándar de oro actual para evaluar la función CFTR, en los mismos pacientes. La corriente de cortocircuito difiere del ensayo de hinchazón porque el primero mide la función CFTR a través del transporte iónico26. En contraste, este ensayo mide un efecto más aguas abajo con el transporte de fluidos, proporcionando información adicional sobre la función general de CFTR 27,28,29,30,31,32. Las mediciones de corriente de cortocircuito han seguido siendo un método común y fiable para determinar la actividad del canal de cloruro CFTR 1,33. Estos ensayos electrofisiológicos requieren equipos especializados y costosos, requieren muchas veces más células para cada réplica experimental que el ensayo organoide, no se pueden automatizar fácilmente y no son susceptibles de escalar para aplicaciones de mayor rendimiento. Otro modelo organoide derivado de epitelios intestinales tiene ventajas adicionales 15,16,17,18, como una capacidad replicativa más excelente, pero no se deriva de un tejido de las vías respiratorias ni está disponible universalmente. Los cepillados HNE se obtienen con cepillos de citología de bajo costo sin necesidad de sedación y con un riesgo mínimo. Obtener el cepillado no requiere un médico y puede ser realizado por coordinadores de investigación capacitados y otro personal de investigación14. El modelo organoide HNE puede ser cultivado por cualquier laboratorio con capacidades de cultivo celular primario, y algunas de las aplicaciones se pueden realizar con técnicas de microscopía estándar. En conjunto, estas ventajas proporcionan acceso adicional a la tecnología para evaluar la función epitelial de las vías respiratorias que de otro modo podría no estar disponible para algunos laboratorios. Además, los organoides HNE se pueden utilizar para estudiar otros estados de enfermedad que afectan a las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria25 o la infección viral, que los organoides intestinales no pueden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito proporciona metodologías detalladas para imágenes completas en vivo y fijas de los organoides epiteliales de las vías respiratorias derivados de la biopsia con cepillo HNE. Describe ensayos funcionales que pueden determinar la actividad de CFTR en un individuo. Los HNE proporcionan un tejido primario mínimamente invasivo para una variedad de aplicaciones. Las técnicas de expansión ofrecidas aquí se pueden utilizar para modelar la enfermedad de las vías respiratorias, incluidos los organoides. Los …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos las contribuciones de todos los participantes que donaron biopsias con cepillo HNE para desarrollar este protocolo. Agradecemos a Latona Kersh y al personal de la Unidad de Investigación Infantil por coordinar el reclutamiento de voluntarios del estudio y la recolección de muestras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey y Stephen Mackay, ex aprendices en nuestro laboratorio, por su asistencia técnica. Agradecemos a Zhong Liu y Rui Zhao por su ayuda técnica. Steven M. Rowe, director del Centro de Investigación de CF de la UAB, aporta liderazgo y recursos, sin los cuales este trabajo no sería posible. También nos gustaría agradecer a Sarah Guadiana de Biotek por su ayuda con la formación de instrumentos, a Robert Grabski por la asistencia en microscopía confocal en el Centro de Imágenes de Alta Resolución de la UAB y a Dezhi Wang por la asistencia histológica en el Núcleo de Histología de la UAB. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Subvención K23HL143167 (a JSG), Subvención de la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) GUIMBE18A0-Q (a JSG), el Centro de Fibrosis Quística Gregory Fleming James [NIH Grants R35HL135816 y DK072482 y el Programa de Investigación y Desarrollo de la Universidad CFF de Alabama en Birmingham (UAB) (Rowe19RO)], y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la UAB (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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