İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi
Summary
Burada insan burun epitel hücrelerinden in vitro organoid modeli tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Protokol, standart laboratuvar ekipmanı gerektiren ölçümler için seçeneklere ve özel ekipman ve yazılımlar için ek olanaklara sahiptir.
Abstract
Kistik fibrozis (KF) hastaları için bireyselleştirilmiş tedavi, küçük moleküllü bileşiklerden temel Kistik Fibrozis Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini ve restorasyonunu anlamak için in vitro bir hastalık modeli ile sağlanabilir. Grubumuz son zamanlarda doğrudan birincil insan burun epitel hücrelerinden (HNE) türetilen iyi diferansiye bir organoid model oluşturmaya odaklandı. Kesitli organoidlerin histolojisi, tam montajlı immünofloresan boyama ve görüntüleme (konfokal mikroskopi, immünofloresan mikroskopi ve parlak alan kullanılarak), organoidleri karakterize etmek ve fonksiyonel testlere hazırlanırken epitel farklılaşmasını doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, HNE organoidleri, CF ve CF olmayan organoidler arasında ayrım yaparak, CFTR aktivitesi ile ilişkili farklı boyutlarda lümenler üretir. Bu makalede, HNE organoidlerinin kültürlenmesi için metodoloji, bazal lümen alanının ölçümü (mikroskoplu herhangi bir laboratuvarın kullanabileceği organoidlerde CFTR aktivitesi ölçümü yöntemi) ve fonksiyonel bir tahlil için geliştirilmiş otomatik yaklaşım (daha özel ekipman gerektiren) dahil olmak üzere görüntüleme modaliteleri kullanılarak farklılaşmanın değerlendirilmesine odaklanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Introduction
Tekniğe giriş
Ex vivo kültür temelli tahliller, hassas tıp ve hastalık patofizyolojisinin incelenmesi için giderek daha fazla kullanılan bir araçtır. Primer insan nazal epitel (HNE) hücre kültürü, kistik fibroz 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ile ilgili çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. , birden fazla organda epitel hücre fonksiyonunu etkileyen otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. HNE kültürü, prospektif olarak elde edilebilen yenilenebilir bir hava yolu epitelisi kaynağı sağlar ve Kistik Fibroz Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini test etmek için elektrofizyolojik ve biyokimyasal nitelikleri özetler. HNE hücreleri, yaygın viral solunum yolu çubuklarına benzer şekilde minimal yan etki14 ile örneklenebilir. HNE fırça biyopsilerinden türetilen kistik fibroz çalışması için bir model tanımlayan araştırma çalışması yakın zamanda yayınlanmıştır11,13. Primer HNE 2,3 ve bağırsak dokusu 15,16,17,18,19 kullanan diğer modellere benzer olmakla birlikte, bu modelin farklılaşmasının ve görüntülenmesinin ayrıntılı karakterizasyonu, KF araştırmalarında kullanılmak ve diğer hava yolu hastalıklarının çalışmalarına yardımcı olmak için burada açıklanmıştır 13 . Organoid model, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sınırsız değildir, ancak koşullu yeniden programlama (ışınlanmış ve inaktive edilmiş besleyici fibroblastlar ve Rho-kinaz inhibitörleri kullanılarak) ile daha kök hücre benzeri bir durumagenişletilebilir 20,21,22,23. HNE fırça biyopsilerinin bu yöntem kullanılarak işlenmesi, birden fazla uygulamada kullanılmak üzere çok sayıda epitel hücresinin daha yüksek verimde olmasını sağlarken, yine de tam olarak ayırt etme yeteneğini korur. Bu protokol besleyici hücreler kullanılarak geliştirilmiş olsa da, besleyici hücre teknolojisinden kaçınmak isteyen araştırmacılar tarafından başka metodolojiler de kullanılabilir14,24.
Tekniğin pulmoner biyolojideki önemi
Epitel hücrelerinin hücre zarında düzenli, işleyen CFTR’nin yokluğunun akciğerlerde, pankreasta, karaciğerde, bağırsakta veya diğer dokularda nasıl işlev bozukluğuna neden olduğunu anlamak için önemli bir çalışma yapılmıştır. Disfonksiyonel epitel iyon transportu, özellikle klorür ve bikarbonat, epitel astar sıvılarının hacminin azalmasına ve mukoza sekresyonlarında değişikliklere neden olarak mukoza stazı ve tıkanıklığına neden olur. Primer siliyer diskinezi gibi diğer hava yolu hastalıklarında, değişmiş siliyer hareket mukosiliyer klirensi bozar ve mukoza stazı ve obstrüksiyona yol açar25. Bu nedenle, mevcut HNE organoid modeli, araştırmacının deneysel tasarımına ve kaynaklarına bağlı olarak çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir. Bu, canlı hücre boyaları kullanarak canlı hücre görüntülemeyi içerir; morfolojiyi karakterize etmek için sabitleme ve bölümleme; intraluminal yapıların bozulmasını önlemek için antikorlarla immünofloresan boyama ve tam montajlı konfokal görüntüleme; siliyer atım sıklığı ve mukosiliyer transportun kantitatif ölçümleri için parlak alan görüntüleme ve mikro-optik koherens tomografi13. Diğer araştırmacılara genişlemeyi kolaylaştırmak için, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve malzemeler kültürleme için kullanılmıştır. Ortak mikroskop teknikleri ve daha özel ekipman kullanan fonksiyonel bir tahlil geliştirilmiştir. Genel olarak, mevcut model CFTR aktivitesini başlangıçta veya terapötiklere yanıt olarak değerlendirmek için tasarlanmış olsa da, bu protokolde açıklanan teknikler epitel hücre fonksiyonunu içeren diğer hastalıklara, özellikle epitel hücre sıvısı taşınımına uygulanabilir.
Diğer metodolojilerle karşılaştırma
Son zamanlarda bu organoid modelin yararlılığı, hastaların organoidlerinin in vitro CFTR modülatör yanıtlarını klinik yanıtlarıyla ilişkilendirerek geliştirilmiştir11. Özellikle, mevcut modelin aynı hastalarda CFTR fonksiyonunu değerlendirmek için mevcut altın standart olan kısa devre akım tepkilerine paralel olduğu da gösterilmiştir. Kısa devre akımı, şişme tahlilinden farklıdır, çünkü birincisi, iyon taşıma26 yoluyla CFTR fonksiyonunu ölçer. Buna karşılık, bu tahlil sıvı taşınması ile daha aşağı yönlü bir etkiyi ölçer ve CFTR27,28,29,30,31,32’nin genel işlevi hakkında ek bilgi sağlar. Kısa devre akım ölçümleri, CFTR klorür kanal aktivitesini belirlemek için yaygın ve güvenilir bir yöntem olmaya devam etmiştir 1,33. Bu elektrofizyolojik analizler özel, pahalı ekipman gerektirir, her deneysel kopya için organoid testten çok daha fazla hücre gerektirir, kolayca otomatikleştirilemez ve daha yüksek verim uygulamaları için ölçeklendirmeye uygun değildir. Bağırsak epitelinden türetilen başka bir organoid model, daha mükemmel replikatif yetenek gibi ek avantajlara sahiptir 15,16,17,18, ancak ne bir hava yolu dokusundan türetilir ne de evrensel olarak mevcuttur. HNE fırçalamaları, ucuz sitoloji fırçaları ile sedasyona gerek kalmadan ve minimum risk altında elde edilir. Fırçalama yaptırmak bir klinisyen gerektirmez ve eğitimli araştırma koordinatörleri ve diğer araştırma personeli tarafından yapılabilir14. HNE organoid modeli, primer hücre kültürü yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvar tarafından kültürlenebilir ve bazı uygulamalar standart mikroskopi teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Toplamda, bu avantajlar, aksi takdirde bazı laboratuvarlarda kullanılamayan hava yolu epitel fonksiyonunu değerlendirmek için teknolojiye ek erişim sağlar. Ayrıca, HNE organoidleri, bağırsak organoidlerinin yapamayacağı primer siliyer diskinezi25 veya viral enfeksiyon gibi hava yolunu etkileyen diğer hastalık durumlarını incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, HNE fırça biyopsisinden türetilen hava yolu epitel organoidlerinin kapsamlı canlı ve sabit görüntülenmesi için ayrıntılı metodolojiler sunulmaktadır. Bir bireyde CFTR aktivitesini belirleyebilen fonksiyonel testleri tanımlar. HNE’ler, çeşitli uygulamalar için minimal invaziv, birincil doku sağlar. Burada sunulan genişleme teknikleri, organoidler de dahil olmak üzere hava yolu hastalıklarını modellemek için kullanılabilir. Organoidler, hassas terapötik yaklaşımlar için ve zaman iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolü geliştirmek için HNE fırça biyopsileri bağışlayan tüm katılımcıların katkılarını minnetle kabul ediyoruz. Latona Kersh ve Çocuk Araştırma Birimi personeline, çalışma gönüllüsü işe alımını ve örnek koleksiyonlarını koordine ettikleri için teşekkür ederiz. Teknik yardım için laboratuvarımızdaki eski stajyerler olan Lily Deng, Johnathan Bailey ve Stephen Mackay’a teşekkür ederiz. Zhong Liu ve Rui Zhao’ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. UAB’deki CF Araştırma Merkezi Direktörü Steven M. Rowe, bu çalışmanın mümkün olmayacağı liderlik ve kaynaklar sağlar. Ayrıca, enstrüman eğitimi konusundaki yardımı için Biotek’ten Sarah Guadiana’ya, UAB Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisi’nde konfokal mikroskopi yardımı için Robert Grabski’ye ve UAB Histoloji Çekirdeği’nde histolojik yardım için Dezhi Wang’a teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir. Hibe K23HL143167 (JSG’ye), Kistik Fibroz Vakfı (CFF) Hibe GUIMBE18A0-Q (JSG’ye), Gregory Fleming James Kistik Fibrozis Merkezi [NIH Grants R35HL135816 ve DK072482 ve CFF Birmingham’daki Alabama Üniversitesi (UAB) Araştırma ve Geliştirme Programı (Rowe19RO)] ve UAB Klinik ve Translasyonel Bilimler Merkezi (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
