우리는 생분해성 임플란트 재료의 시험관내 세포 적합성을 평가하기 위해 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양의 세 가지 방법을 소개합니다. 이러한 시험관 내 방법은 상이한 생체내 세포-임플란트 상호작용을 모방하고 다양한 생분해성 물질을 연구하는데 적용될 수 있다.
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방법 논문
체외에서 생분해성 임플란트 재료를 연구하기 위한 직접 및 간접 배양 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
지난 수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과, 치과 및 두개골 안면 임플란트와 같은 생물 의학 응용 분야를 위해 광범위하게 탐구되었습니다. 생분해성 물질을 생체의학 응용을 위해 스크리닝하기 위해서는 시험관내 세포 반응, 세포 적합성 및 세포독성 측면에서 이들 물질을 평가할 필요가 있다. 국제 표준화기구 (ISO) 표준은 생체 재료 평가에 널리 활용되었습니다. 그러나 대부분의 ISO 표준은 원래 비분해성 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 확립되었으므로 생분해 성 물질 스크리닝에 제한된 가치를 제공합니다.
이 기사에서는 세 가지 다른 배양 방법, 즉 직접 배양 방법, 직접 노출 배양 방법 및 생분해성 폴리머, 세라믹, 금속 및 그 복합체를 포함한 생분해 성 임플란트 재료의 시험관 내 세포 적합성을 평가하기위한 노출 배양 방법을 소개하고 논의합니다. 연구에 따르면 배양 방법은 동적 분해가 계면과 지역 환경에서 시공간 차이를 유도하기 때문에 생분해성 물질에 대한 세포 반응에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다. 구체적으로, 직접 배양 방법은 임플란트에 직접 시딩된 세포의 반응을 드러낸다; 직접 노출 배양 방법은 임플란트와 접촉하는 확립 된 숙주 세포의 반응을 해명합니다. 노출 배양 방법은 임플란트와 직접 접촉하지는 않지만 임플란트 분해로 인한 국소 환경의 변화에 의해 영향을받는 확립 된 숙주 세포를 평가합니다.
이 기사에서는 생분해성 임플란트 물질의 시험관내 세포 적합성 및 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BMSCs)와의 상호 작용을 연구하기 위한 이러한 세 가지 배양 방법의 예를 제공합니다. 또한 수확, 계대, 배양, 종자, 고정, 염색, 세포 특성화 및 배양 후 배지 및 재료 분석 방법을 설명합니다. 이 기사에서 설명된 시험관내 방법은 생체내 환경의 상이한 시나리오를 모방하여, 다양한 생체의학적 응용을 위한 상이한 생체재료의 시험관내 세포적합성 시험의 적용가능성 및 관련성을 넓힌다.
서론
수십 년 동안 생분해 성 물질은 정형 외과1,2, dental3,4 및 craniomaxillofacial5 응용 분야와 같은 생물 의학 응용 분야에서 광범위하게 연구되고 사용되었습니다. 영구 임플란트 및 재료와 달리 생분해 성 금속, 세라믹, 폴리머 및 그 복합체는 생리 환경에서 다양한 화학 반응을 통해 시간이 지남에 따라 체내에서 점차 분해됩니다. 예를 들어, 마그네슘 (Mg) 합금1,6,7 및 아연 (Zn) 합금8,9와 같은 생분해 성 금속은 뼈 고정 장치의 유망한 재료입니다. 그들의 생분해성은 뼈 치유 후 임플란트를 제거하기 위해 이차 수술의 필요성을 제거 할 수 있습니다. 인산칼슘 시멘트(CPCs)와 같은 생분해성 세라믹은 경피적 척추성형술에서 골다공증 척추 압박 ....
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프로토콜
이 프로토콜은 세포 및 조직 수확을 위해 리버 사이드 캘리포니아 대학 (UCR)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 12 주 된 암컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐가 비디오에 예로 나와 있습니다. 젊은 암컷과 수컷 쥐가 선호됩니다.
1. 세포 배양 준비
참고: 이 문서에 설명된 세 가지 배양 방법은 일반적으로 부착되는 다른 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 여기서, 래트 이유식으로부터 수확된 BMSCs는 세포 배양 준비를 위한 예로서 도입될 것이다. 특정 의료 용도에 대한 관련성에 따라, 동물 또는 인간 기증자로부터 수확한 일차 세포 및 세포/조직 은행으로부터의 세포주를 포함하여 상이한 세포 유형이 이용될 수 있다.
- 쥐 이유식에서 BMSC를 수확
참고: 그림 1 의 개략도는 쥐 이유식에서 BMSC를 수확하는 단계를 보여줍니다.- CO2 흡입으로 Sprague Dawley (SD) 쥐를 안락사시킵니다.
- 피부와 근육 및 결합 조직을 제거하여 안락사 된 쥐에서 대퇴골을 해부하십시오. 대퇴골 뼈를 세포 ....
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결과
도 4는 상이한 배양 방법을 이용한 직접 및 간접 접촉 조건하에서의 BMSCs의 대표적인 형광 이미지를 나타낸다. 도 4A, B는 ZC21 마그네슘 합금1과 동일한 24시간 직접 배양 후 직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 BMSC를 보여준다. ZC21 합금은 97.5 wt % 마그네슘, 2 wt % 아연 및 0.5 wt % 칼슘으로 구성됩니다. ZC21 합금 샘플과 직접 접촉하지 않은 셀은 샘플과 직접 접촉하는 셀보다 더 잘 퍼집니다. 도 4C,D에 나타난 바와 같이, 직접 및 간접 접촉 조건 하에서의 세포는 모두 Fe3+ 이온에 의해 가교된 히알루론산(HyA) 하이드로젤에 24시간 직접 노출된 후 정상적인 형태를 나타낸다. 그러나, 간접 접촉 조건.......
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토론
상이한 세포 배양 방법이 생체내 적용의 다양한 양태에 대해 관심있는 생체재료의 시험관내 세포적합성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 기사에서는 세 가지 시험관 내 배양 방법, 즉 직접 배양, 직접 노출 배양 및 노출 배양을 보여 주어 생분해 성 임플란트 재료가 인체 내부에서 사용되는 다양한 생체 내 시나리오를 모방합니다. 직접 배양 방법은 주로 임플란트 재료에 직접 부착되고 주위하는 새로 시딩된 세포의 거동을 평가하기 위해 사용된다. 직접 노출 배양 방법은 임플란트 재료가 확립 된 세포 및 조직과 직접 접촉하는 생체 내 시나리오를 모방합니다. 노출 배양 방법은 임플란트 재료로부터의 분해 생성물 및 국소 미세 환경의 변화가 임플란트 재료와 직접 접촉하지 않는 확립된 세포 및 조직에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 보여주기 위해 사용될 수 있다.
직접 배양에서, 직접 및 간접 접촉 조건 둘 다하에서 새로.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 미국 국립 과학 재단 (NSF CBET 상 1512764 및 NSF PIRE 1545852), 국립 보건원 (NIH NIDCR 1R03DE028631), 캘리포니아 대학 (UC) 리젠트 교수 개발 펠로우십, 연구 종자 보조금위원회 (Huinan Liu) 및 UC-Riverside 논문 연구 보조금 (Jiajia Lin)의 재정 지원에 감사드립니다. 저자들은 SEM/EDS를 사용하기 위해 UC-Riverside의 CFAMM(Advanced Microscopy and Microanalysis) 중앙 시설(CFAMM)과 XRD 기기 사용을 위한 페리 청 박사를 높이 평가합니다. 저자는 또한 부분 편집을 위해 Thanh Vy Nguyen과 Queenie Xu를 높이 평가합니다. 저자는 또한 비디오에 대한 내레이션을 녹음 한 Cindy Lee에게 감사하고 싶습니다. 이 기사에서 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 국립 과학 재단 또는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 견해를 반드시 반영하지는 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 490019-704 | |
| 12-웰 조직 배양 처리 플레이트 | Thermo Fisher Scientific | 353043 | |
| 15 mL 원뿔형 튜브(폴리프로필렌) | VWR | 89039-666 | |
| 18 G 바늘 | BD | 305196 | |
| 25½ G 바늘 | BD | 305122 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브(폴리프로필렌) | VWR | 89039-658 | |
| 70 μ m 나일론 스트레이너 | Fisher Scientific | 50-105-0135 | |
| Alexa Flour 488-phalloidin | Life technologies | A12379 | |
| 생물 안전 캐비닛 | LABCONCO | Class II, Type A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Rotor F-35-6-30, Centrifuge5430 | |
| Clear Fused Quartz Round Dish | AdValue Technology | FQ-4085 | |
| CO2 인큐베이터 | SANYO | MCO-19AIC | |
| CoolCell Freezer 용기 | 감소를 조절하도록 설계된 | Corning | 432000 |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 5000-1020 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| EDX 분석 소프트웨어 | Oxford Instruments | AztecSynergy | |
| 에너지 분산 X선 분광법 (EDX) | FEI | 50mm2 X-Max50 SDD | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 형광 현미경 | Nikon | Eclipse Ti | |
| 포름알데히드 | VWR | 100496-496 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| ImageJ 소프트웨어 | National Institutes of Health 및 광학 및 컴퓨터 계측 연구소(LOCI, University of Wisconsin) | ||
| 유도 결합 플라즈마 선광 방출 분광법(ICP-OES) | PerkinElmer | Optima 8000 | |
| 광학 현미경 | VWR | VistaVision | |
| 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) | Thermo Fisher Scientific, Inc., | 15070063 | |
| pH meter | VWR | model SB70P | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 97062-730 | |
| 스캐닝 전자 현미경 (SEM) | FEI | Nova NanoSEM 450 | |
| 수술 블레이드 | VWR | 76353-728 | |
| 조직 배양 플라스크 | VWR | T-75, MSPP-90076 | |
| Transwell 인서트 | Corning | 3460 | |
| 트립신-에틸렌 디아민 테트라 아세트산 용액 (트립신 -EDTA) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| X선 회절 기기 (XRD) | PANalytical | Empyrean Series 2 |
참고문헌
- Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
- Xu, C., et al.
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