تحديد نفقات الطاقة القاعدية وقدرة الخلايا الشحمية الحرارية على إنفاق الطاقة في الفئران البدينة
Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لقياس معدل الأيض القاعدي والقدرة التأكسدية للخلايا الدهنية الحرارية في الفئران البدينة.
Abstract
قياسات الإنفاق على الطاقة ضرورية لفهم كيف يمكن أن تؤدي التغيرات في التمثيل الغذائي إلى السمنة. يمكن تحديد نفقات الطاقة القاعدية في الفئران عن طريق قياس استهلاك الأكسجين في الجسم كله ، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون ، والنشاط البدني باستخدام أقفاص التمثيل الغذائي. تساهم الخلايا الدهنية البنية/البيج الحرارية (BA) بشكل كبير في نفقات طاقة القوارض ، خاصة في درجات الحرارة المحيطة المنخفضة. هنا، يتم وصف قياسات الإنفاق على الطاقة القاعدية والقدرة الإجمالية لمكتبة الإسكندرية على إنفاق الطاقة في الفئران البدينة في بروتوكولين مفصلين: الأول يشرح كيفية إعداد المقايسة لقياس نفقات الطاقة القاعدية باستخدام تحليل التباين المشترك (ANCOVA)، وهو تحليل ضروري بالنظر إلى أن نفقات الطاقة تختلف بشكل مشترك مع كتلة الجسم. يصف البروتوكول الثاني كيفية قياس قدرة مكتبة الإسكندرية على الإنفاق على الطاقة في الجسم الحي في الفئران. هذا الإجراء ينطوي على التخدير، اللازمة للحد من الإنفاق الناجم عن النشاط البدني، تليها حقن ناهض بيتا3 الأدرينالية، CL-316،243، الذي ينشط الإنفاق على الطاقة في مكتبة الإسكندرية. يتم وصف هذين البروتوكولين وحدودهما بتفصيل كاف للسماح بتجربة أولى ناجحة.
Introduction
يمكن تعريف الأيض بأنه تكامل التفاعلات الكيميائية الحيوية المسؤولة عن امتصاص المغذيات وتخزينها وتحويلها وانهيارها الذي تستخدمه الخلايا للنمو وأداء وظائفها. تحول التفاعلات الأيضية الطاقة الموجودة في المواد الغذائية إلى شكل يمكن استخدامه من قبل الخلايا لتجميع جزيئات جديدة وتنفيذ العمل. هذه التفاعلات الكيميائية الحيوية هي بطبيعتها غير فعالة في تحويل هذه الطاقة إلى شكل قابل للاستخدام للحفاظ على الحياة1. ويؤدي عدم الكفاءة هذا إلى تبديد الطاقة في شكل حرارة، حيث يستخدم هذا الإنتاج الحراري لتحديد معدل الأيض القياسي (SMR) للكائن الحي1. تم تعريف الحالة القياسية كلاسيكيا على أنها إنتاج الحرارة الذي يحدث في شخص بالغ مستيقظ ولكنه يستريح ، وليس تناول الطعام أو هضمه ، في الترموكرالية ودون أي إجهاد1. ويشار إلى معدل الأيض القاعدي (BMR) أو نفقات الطاقة القاعدية في الفئران باسم SMR ولكن في الأفراد تناول وهضم الطعام تحت ضغط حراري خفيف (درجات الحرارة المحيطة 21-22 درجة مئوية)1. جعلت التحديات والصعوبات التي تواجه قياس إنتاج الحرارة مباشرة قياس السعرات الحرارية غير المباشرة ، وهي حساب إنتاج الحرارة من قياسات استهلاك الأكسجين ، لتصبح النهج الأكثر شعبية لتحديد BMR. حساب BMR من استهلاك الأكسجين ممكن لأن أكسدة المواد الغذائية عن طريق الميتوكوندريا لتجميع ATP هي المسؤولة عن 72٪ من إجمالي الأكسجين المستهلكة في كائن حي، مع 8٪ من إجمالي استهلاك الأكسجين تحدث أيضا في الميتوكوندريا ولكن دون توليد ATP (التنفس غير المقترن)1. يمكن أن يعزى معظم 20٪ المتبقية من الأكسجين المستهلكة إلى أكسدة المغذيات في مواقع أخرى دون الخلوية (أكسدة الأحماض الدهنية البيروكسيسومال)، والعمليات الابتنائية، وتشكيل أنواع الأكسجين التفاعلي1. وهكذا، في عام 1907، وضعت لوسك معادلة، استنادا إلى القياسات التجريبية، وتستخدم على نطاق واسع لتحويل استهلاك الأكسجين وإنتاج ثاني أكسيد الكربون إلى تبديد الطاقة والحرارة. في البشر، يمثل الدماغ ~ 25٪ من BMR، والنظام العضلي الهيكلي ل ~ 18.4٪، والكبد ل ~ 20٪، والقلب ل ~ 10٪، والأنسجة الدهنية ل ~ 3-7٪2. في الفئران ، ومساهمة الأنسجة في BMR مختلفة قليلا ، مع الدماغ تمثل ~ 6.5 ٪ ، والعضلات الهيكلية ~ 13 ٪ ، والكبد ~ 52 ٪ ، والقلب ~ 3.7 ٪ ، والأنسجة الدهنية ~ 5 ٪ 3.
ومن اللافت للنظر أن التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تحدد معدل نمو الأنسجة غير ثابتة وتتغير استجابة للاحتياجات المختلفة، مثل العمل الخارجي (النشاط البدني)، والتنمية (نمو الأنسجة)، والضغوط الداخلية (مواجهة العدوى والإصابات ودوران الأنسجة)، والتغيرات في درجة الحرارة المحيطة (الدفاع البارد)1. بعض الكائنات الحية بنشاط تجنيد العمليات لتوليد الحرارة في التعرض للبرد، مما يعني أن الحرارة الناتجة عن التمثيل الغذائي ليست مجرد نتيجة ثانوية عرضية. وبدلا من ذلك، اختار التطور آليات تنظيمية يمكن أن ترفع على وجه التحديد من إنتاج الحرارة عن طريق تغيير معدل التفاعلات الأيضية1. وهكذا، يمكن استخدام نفس قياسات استهلاك الأكسجين هذه لتحديد قدرة الكائن الحي على توليد الحرارة استجابة للبرد.
تساهم عمليتان رئيسيتان في توليد الحرارة عند التعرض للبرد. الأول هو يرتجف، الذي يولد الحرارة عن طريق زيادة الفوسفور التأكسدي الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في العضلات لتغطية العمل البدني الذي يقوم به تقلص العضلات اللاإرادي. لذلك، فإن التعرض للبرد يزيد من استهلاك الأكسجين في العضلات1. والثاني هو توليد الحرارة غير الرجفة ، والذي يحدث من خلال زيادة في استهلاك الأكسجين في الخلايا الدهنية البني والبيج (BA). يتم التوسط تبديد الطاقة في الحرارة في مكتبة الإسكندرية عن طريق البروتين الميتوكوندريا فك 1 (UCP1)، والذي يسمح بالبروتونات العودة إلى مصفوفة الميتوكوندريا، مما يقلل من تدرج بروتون الميتوكوندريا. تبديد التدرج بروتون الميتوكوندريا من قبل UCP1 يزيد من إنتاج الحرارة من خلال الارتفاع في نقل الإلكترونات واستهلاك الأكسجين والطاقة الصادرة عن تبديد البروتون في حد ه دون توليد ATP (غير متفككة). وعلاوة على ذلك، يمكن أن BA الحرارية تجنيد آليات إضافية ترفع استهلاك الأكسجين دون التسبب في تبديد كبير في تدرج البروتون، عن طريق تفعيل التوليف التأكسدي غير مجدية ATP ودورات الاستهلاك. الأقفاص الأيضية الموصوفة هنا ، وهي نظام CLAMS-Oxymax من Columbus Instruments ، توفر إمكانية قياس نفقات الطاقة في درجات حرارة محيطة مختلفة. ومع ذلك، لتحديد قدرة BA الحرارية باستخدام قياسات استهلاك الأكسجين في الجسم كله، يحتاج المرء إلى: (1) القضاء على مساهمة الرجفة، وغيرها من العمليات الأيضية غير BA للإنفاق على الطاقة، و (2) تنشيط النشاط الحراري BA على وجه التحديد في الجسم الحي. وهكذا، يصف بروتوكول ثان كيفية تنشيط BA بشكل انتقائي في الجسم الحي باستخدام الصيدلة في الفئران المخدرة في درجة الحرارة (30 درجة مئوية)، مع التخدير والحرارة الحد من العمليات الحرارية الأخرى غير BA (أي النشاط البدني). الاستراتيجية الدوائية لتنشيط BA هو علاج الفئران مع مستقبلات β3-adrenergic ناهض CL-316,246. والسبب هو أن التعرض للبرد يعزز استجابة متعاطفة الإفراج عن النورادرينالين لتنشيط مستقبلات β الأدرينالية في BA, الذي ينشط UCP1 وأكسدة الدهون. وعلاوة على ذلك، β3-adrenergic مستقبلات التعبير هو غنية للغاية في الأنسجة الدهنية في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم قياس السعرات الحرارية غير المباشر لسنوات لتقييم نفقات الطاقة في كامل الجسم4. يوفر هذا البروتوكول الموصوف هنا طريقة مباشرة لقياس معدل الأيض القاعدي وتحديد قدرة BA الحرارية في الجسم الحي باستخدام أقفاص التمثيل الغذائي.
تؤكد طريقة قياس السعرات الح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل ML من قبل قسم الطب في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والمنح التجريبية من P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) وP30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
- Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
- Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
- Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
- Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
- Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
- Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
- Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).
