O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.
O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes, sendo os pulmões o local metastático mais comum. A taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar é inferior a 30%. Portanto, a utilização de modelos de camundongos imitando o desenvolvimento do osteossarcoma em humanos é de grande importância para a compreensão do mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapêuticas. Aqui, procedimentos detalhados são relatados para gerar os modelos primários de osteossarcoma e metástase pulmonar através da injeção de intratibia de células osteossarcoma. Combinados com o sistema de bioluminescência ou imagem viva de raios-X, esses modelos de camundongos vivos são utilizados para monitorar e quantificar o crescimento e a metástase do osteossarcoma. Para estabelecer esse modelo, uma matriz de membrana de porão contendo células osteossarcoma foi carregada em uma seringa de micro volume e injetada em uma tíbia de cada rato atímico após ser anestesiada. Os camundongos foram sacrificados quando o osteossarcoma primário atingiu a limitação de tamanho no protocolo aprovado pela IACUC. As pernas com osteossarcoma e os pulmões com lesões de metástase foram separados. Esses modelos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido, lesões graves e sensibilidade no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas primárias e pulmonares. Portanto, estes são modelos ideais para explorar as funções e mecanismos de fatores específicos na carcinogênese osteossarcoma e metástase pulmonar, o microambiente tumoral e avaliar a eficácia terapêutica in vivo.
O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes 1,2, que se infiltra principalmente no tecido circundante, e até mesmo metástase nos pulmões quando os pacientes são diagnosticados. A metástase pulmonar é o principal desafio para a terapia osteossarcoma, e a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar permanece tão baixa quanto 20%-30%3,4,5. No entanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos de osteossarcoma primário foi aumentada para cerca de 70% desde a década de 1970 devido à introdução da quimioterapia6. Portanto, é urgentemente necessário entender o mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapias. A aplicação de modelos de camundongos que melhor imitam a progressão do osteossarcoma em humanos é de grande significado7.
Os modelos animais osteossarcoma são gerados por engenharia genética espontânea e induzida, transplante e outras técnicas. O modelo de osteossarcoma espontâneo raramente é utilizado devido ao longo tempo de formação do tumor, taxa de ocorrência de tumor inconsistente, baixa morbidade e baixa estabilidade 8,9. Embora o modelo de osteossarcoma induzido seja mais acessível para obter do que o osteossarcoma espontâneo, a aplicação do modelo osteossarcoma induzido é limitada porque o fator indutor afetará o microambiente, a patogênese e características patológicas da osteossarcoma10. Modelos transgênicos estão ajudando a entender a patogênese dos cânceres, pois podem simular melhor os ambientes fisiológicos e patológicos humanos; no entanto, os modelos animais transgênicos também têm suas limitações devido à dificuldade, a longo prazo e alto custo de modificação transgênica. Além disso, mesmo nos modelos de animais transgênicos mais amplamente aceitos gerados pela modificação genética p53 e rb, apenas 13,6% do sarcoma ocorreu nos ossos de quatro membros11,12.
O transplante é um dos métodos de produção de câncer metastáticos primários e distantes mais utilizados nos últimos anos devido à sua manobra simples, taxa de formação de tumores estáveis e melhor homogeneidade13. O transplante inclui transplante heterotópico e transplante ortotópico de acordo com os locais de transplante. No transplante heterotópico osteossarcoma, as células osteossarcoma são injetadas fora dos sítios osteossarcoma primários (osso) dos animais, comumente sob a pele, subcutâneamente14. Embora o transplante heterotópico seja simples sem a necessidade de realizar cirurgia em animais, os locais onde as células osteossarcoma são injetadas não representam o microambiente osteossarcoma humano real. Transplante ortotópico osteossarcoma é quando as células osteossarcoma são injetadas nos ossos dos animais, como a tíbia15,16. Em comparação com os enxertos heterotópicos, os enxertos de osteossarcoma ortotópicos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido e forte natureza erosiva; portanto, são modelos animais ideais para estudos relacionados ao osteossarcoma17.
Os animais mais usados são camundongos, cães e zebrafish18,19. O modelo espontâneo de osteossarcoma é geralmente usado em caninos porque o osteossarcoma é um dos tumores mais comuns em caninos. No entanto, a aplicação desse modelo é limitada devido ao longo tempo de formação do tumor, à baixa taxa de tumorigênese, à má homogeneidade e à estabilidade. Zebrafishes são frequentemente usados para construir modelos de tumor transgênicos ou nocaute por causa de sua reprodução rápida20. Mas os genes dos zebrafish são diferentes dos genes humanos, então suas aplicações são limitadas.
Este trabalho descreve os procedimentos detalhados, precauções e imagens representativas para a produção do osteossarcoma primário na tíbia com metástase pulmonar por injeção intratibia de células osteossarcoma em camundongos atrímicos. Este método foi aplicado para criar o osteossarcoma primário na tíbia do camundongo para avaliação da eficácia terapêutica, que apresentou alta reprodutibilidade21,22.
A injeção ortotópica de células osteossarcoma é um modelo ideal para estudar a função e o mecanismo de fatores específicos na carcinogênese e desenvolvimento da osteossarcoma para avaliar a eficácia terapêutica. Para evitar diferenças no crescimento do tumor, a maioria das células de osteossarcoma ativas a 80%-90% confluentes com o mesmo número são cuidadosamente injetadas na tíbia de cada rato, e o tempo de experimentação celular é estritamente controlado sem afetar a viabilidade celular. Como as aglo…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado por bolsas do (1) Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |