Intratibial osteosarkomcelleinjektion til generering af ortotopisk osteosarkom og lungemetastase musemodeller
Summary
Den nuværende protokol beskriver intratibia osteosarkomcelleinjektion for at generere musemodeller med ortotopisk osteosarkom og lungemetastaselæsioner.
Abstract
Osteosarkom er den mest almindelige primære knoglekræft hos børn og unge, med lunger som det mest almindelige metastatiske sted. Den femårige overlevelsesrate for osteosarkompatienter med lungemetastase er mindre end 30%. Derfor er brugen af musemodeller, der efterligner osteosarkomudviklingen hos mennesker, af stor betydning for forståelsen af den grundlæggende mekanisme for osteosarkom carcinogenese og lungemetastase til at udvikle nye terapier. Her rapporteres detaljerede procedurer for at generere de primære osteosarkom- og lungemetastasemusemodeller via intratibia injektion af osteosarkomceller. Kombineret med bioluminescens eller røntgen levende billeddannelsessystem bruges disse levende musemodeller til at overvåge og kvantificere osteosarkomvækst og metastase. For at etablere denne model blev en kældermembranmatrix indeholdende osteosarkomceller indlæst i en mikrovolumensprøjte og injiceret i en skinneben af hver athymisk mus efter at være blevet bedøvet. Musene blev ofret, da det primære osteosarkom nåede størrelsesbegrænsningen i den IACUC-godkendte protokol. Benene med osteosarkom og lungerne med metastaselæsioner blev adskilt. Disse modeller er kendetegnet ved en kort inkubationsperiode, hurtig vækst, alvorlige læsioner og følsomhed ved overvågning af udviklingen af primære og lungemetasstatiske læsioner. Derfor er disse ideelle modeller til at udforske funktionerne og mekanismerne for specifikke faktorer i osteosarkom carcinogenese og lungemetastase, tumormikromiljøet og evaluering af den terapeutiske effekt in vivo.
Introduction
Osteosarkom er den mest almindelige primære knoglekræft hos børn og unge 1,2, som hovedsageligt infiltrerer det omgivende væv og endda metastaserer til lungerne, når patienterne diagnosticeres. Lungemetastase er den største udfordring for osteosarkombehandling, og den femårige overlevelsesrate for osteosarkompatienter med lungemetastase forbliver så lav som 20% -30%3,4,5. Imidlertid er den femårige overlevelsesrate for primær osteosarkom blevet øget til ca. 70% siden 1970’erne på grund af indførelsen af kemoterapi6. Derfor er det presserende nødvendigt at forstå den grundlæggende mekanisme for osteosarkom carcinogenese og lungemetastase for at udvikle nye terapier. Anvendelsen af musemodeller, der bedst efterligner osteosarkomprogressionen hos mennesker, er af stor betydning7.
Osteosarkom dyremodellerne genereres ved spontan, induceret genteknologi, transplantation og andre teknikker. Den spontane osteosarkommodel anvendes sjældent på grund af den lange tumordannelsestid, inkonsekvent tumorforekomst, lav sygelighed og dårlig stabilitet 8,9. Selvom den inducerede osteosarkommodel er mere tilgængelig at opnå end det spontane osteosarkom, er anvendelsen af den inducerede osteosarkommodel begrænset, fordi den inducerende faktor vil påvirke mikro miljøet, patogenesen og patologiske egenskaber ved osteosarkom10. Transgene modeller hjælper med at forstå patogenesen af kræftformer, da de bedre kan simulere de menneskelige fysiologiske og patologiske miljøer; De transgene dyremodeller har imidlertid også deres begrænsninger på grund af vanskeligheden, de langsigtede og høje omkostninger ved transgen modifikation. Selv i de mest accepterede transgene dyremodeller genereret af p53 og Rb genmodifikation forekom kun 13,6% af sarkom i de fire lemmer knogler11,12.
Transplantation er en af de mest almindeligt anvendte primære og fjerne metastatiske kræftmodelproducerende metoder i de senere år på grund af dens enkle manøvrering, stabile tumordannelseshastighed og bedre homogenitet13. Transplantation omfatter heterotopisk transplantation og ortotopisk transplantation i henhold til transplantationsstederne. Ved osteosarkom heterotopisk transplantation injiceres osteosarkomcellerne uden for dyrenes primære osteosarkomsteder (knogle), almindeligvis under huden, subkutant14. Selvom den heterotopiske transplantation er ligetil uden behov for at udføre kirurgi hos dyr, repræsenterer de steder, hvor osteosarkomcellerne injiceres, ikke det faktiske humane osteosarkommikromiljø. Osteosarkom ortotopisk transplantation er, når osteosarkomcellerne injiceres i dyrs knogler, såsom tibia15,16. Sammenlignet med de heterotopiske transplantater er ortotopiske osteosarkomtransplantater kendetegnet ved en kort inkubationsperiode, hurtig vækst og stærk erosiv karakter; derfor er de ideelle dyremodeller til osteosarkomrelaterede undersøgelser17.
De mest anvendte dyr er mus, hunde og zebrafisk18,19. Den spontane model af osteosarkom anvendes normalt i hjørnetænder, fordi osteosarkom er en af de mest almindelige tumorer hos hjørnetænder. Anvendelsen af denne model er imidlertid begrænset på grund af den lange tumordannelsestid, den lave tumorgenesehastighed, dårlig homogenitet og stabilitet. Zebrafisk bruges ofte til at konstruere transgene eller knockout tumormodeller på grund af deres hurtige reproduktion20. Men zebrafiskgener er forskellige fra menneskelige gener, så deres anvendelser er begrænsede.
Dette arbejde beskriver de detaljerede procedurer, forholdsregler og repræsentative billeder til fremstilling af det primære osteosarkom i skinnebenet med lungemetastase via intratibia injektion af osteosarkomceller i athymiske mus. Denne metode blev anvendt til at skabe det primære osteosarkom i museskinneben til terapeutisk effektevaluering, som viste en høj reproducerbarhed 21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ortotopisk injektion af osteosarkomceller er en ideel model til at studere funktionen og mekanismen for specifikke faktorer i osteosarkom carcinogenese og udvikling for at evaluere den terapeutiske effekt. For at undgå forskelle i tumorvækst injiceres de fleste aktive osteosarkomceller ved 80% -90% sammenflydende med det samme antal omhyggeligt i skinnebenet på hver mus, og celleprøvepsiniseringstiden kontrolleres strengt uden at påvirke cellens levedygtighed. Da celleklumper påvirker celletællingen, hvilket føre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 og 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
References
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
- Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
- Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
- Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
- Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
- Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
- Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
- Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
- Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
- Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
- Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing’s sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
- Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
- Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
- Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
