Den nåværende protokollen beskriver intratibia osteosarcoma celleinjeksjon for å generere musemodeller som bærer ortotopisk osteosarkom og lungemetastase lesjoner.
Osteosarkom er den vanligste primærbenskreft hos barn og ungdom, med lunger som det vanligste metastatiske stedet. Den femårige overlevelsesraten for osteosarcomapasienter med lungemetastase er mindre enn 30%. Derfor er bruken av musemodeller som etterligner osteosarcoma-utviklingen hos mennesker av stor betydning for å forstå den grunnleggende mekanismen for osteosarcoma karsinogenese og lungemetastase for å utvikle nye terapeutiske stoffer. Her rapporteres detaljerte prosedyrer for å generere de primære osteosarkom- og lungemetastasemusmodellene via intratibiainjeksjon av osteosarkomceller. Kombinert med bioluminescens eller røntgen levende bildebehandlingssystem, disse levende musemodeller brukes til å overvåke og kvantifisere osteosarcoma vekst og metastase. For å etablere denne modellen ble en kjellermembranmatrise som inneholder osteosarcoma-celler lastet i en mikrovolumsprøyte og injisert i en tibia av hver athymiske mus etter å ha blitt bedøvet. Musene ble ofret da den primære osteosarcoma nådde størrelsesbegrensningen i den IACUC-godkjente protokollen. Bena med osteosarkom og lungene med metastaseskader ble separert. Disse modellene er preget av en kort inkubasjonsperiode, rask vekst, alvorlige lesjoner og følsomhet for å overvåke utviklingen av primære og lungemetastatiske lesjoner. Derfor er disse ideelle modeller for å utforske funksjonene og mekanismene til spesifikke faktorer i osteosarcoma karsinogenese og lungemetastase, tumormikromiljøet og evaluere den terapeutiske effekten in vivo.
Osteosarkom er den vanligste primærbenskreft hos barn og ungdom 1,2, som hovedsakelig infiltrerer det omkringliggende vevet, og til og med metastaser til lungene når pasientene diagnostiseres. Lungemetastase er hovedutfordringen for osteosarkombehandling, og den femårige overlevelsesraten for osteosarcomapasienter med lungemetastase forblir så lav som 20% -30% 3,4,5. Imidlertid har den femårige overlevelsesraten for primær osteosarcoma blitt økt til ca 70% siden 1970-tallet på grunn av innføring av kjemoterapi6. Derfor er det presserende nødvendig å forstå den grunnleggende mekanismen for osteosarcoma karsinogenese og lungemetastase for å utvikle nye terapier. Anvendelsen av musemodeller som best etterligner osteosarcoma-progresjonen hos mennesker, har stor betydning7.
Osteosarcoma dyremodeller genereres av spontan, indusert genteknologi, transplantasjon og andre teknikker. Den spontane osteosarcoma-modellen brukes sjelden på grunn av den lange tumordannelsestiden, inkonsekvent tumorforekomst, lav sykelighet og dårlig stabilitet 8,9. Selv om den induserte osteosarcoma-modellen er mer tilgjengelig for å oppnå enn den spontane osteosarcoma, er anvendelsen av den induserte osteosarcoma-modellen begrenset fordi den induserende faktoren vil påvirke mikromiljøet, patogenesen og patologiske egenskaper ved osteosarcoma10. Transgene modeller bidrar til å forstå patogenesen av kreft siden de bedre kan simulere de menneskelige fysiologiske og patologiske miljøene; Imidlertid har de transgene dyremodellene også sine begrensninger på grunn av vanskeligheten, langsiktig og høy pris på transgen modifikasjon. Videre, selv i de mest aksepterte transgene dyremodellene generert av p53 og Rb genmodifisering, skjedde bare 13,6% sarkom i de fire lembenene11,12.
Transplantasjon er en av de mest brukte primære og fjerne metastatiske kreftmodellproduserende metodene de siste årene på grunn av sin enkle manøver, stabile tumordannelseshastighet og bedre homogenitet13. Transplantasjon inkluderer heterotop transplantasjon og ortotoptransplantasjon i henhold til transplantasjonsstedene. Ved osteosarkom heterotop transplantasjon injiseres osteosarkomcellene utenfor dyrets primære osteosarkomsteder (bein), vanligvis under huden, subkutant14. Selv om den heterotope transplantasjonen er grei uten nødvendigheten av å utføre kirurgi hos dyr, representerer ikke stedene der osteosarkomcellene injiseres, det faktiske humane osteosarcoma mikromiljøet. Osteosarkom ortotokostransplantasjon er når osteosarkomcellene injiseres i dyrs bein, som tibia15,16. Sammenlignet med de heterotopiske transplantatene, er ortotopiske osteosarcoma grafts preget av en kort inkubasjonsperiode, rask vekst og sterk erosiv natur; Derfor er de ideelle dyremodeller for osteosarcoma-relaterte studier17.
De mest brukte dyrene er mus, hunder og sebrafisk18,19. Den spontane modellen av osteosarkom brukes vanligvis i hjørnetenner fordi osteosarkom er en av de vanligste svulstene i hjørnetenner. Imidlertid er anvendelsen av denne modellen begrenset på grunn av den lange tumordannelsestiden, den lave tumorigenesishastigheten, dårlig homogenitet og stabilitet. Sebrafisk brukes ofte til å konstruere transgene eller knockout tumormodeller på grunn av deres raske reproduksjon20. Men sebrafiskgener er forskjellige fra menneskelige gener, så deres anvendelser er begrenset.
Dette arbeidet beskriver detaljerte prosedyrer, forholdsregler og representative bilder for å produsere den primære osteosarcoma i tibia med lungemetastase via intratibia injeksjon av osteosarcoma celler hos athymiske mus. Denne metoden ble brukt til å lage den primære osteosarkom i mus tibia for terapeutisk effekt evaluering, som viste en høy reproduserbarhet21,22.
Ortotopisk injeksjon av osteosarkomceller er en ideell modell for å studere funksjonen og mekanismen til spesifikke faktorer i osteosarcoma karsinogenese og utvikling for å evaluere den terapeutiske effekten. For å unngå forskjeller i tumorvekst injiseres de fleste aktive osteosarcoma-celler ved 80% -90% samløp med samme tall nøye i tibia av hver mus, og celleforsøkstiden kontrolleres strengt uten å påvirke cellens levedyktighet. Ettersom celleklumper påvirker celletelling som fører til unøyaktige celletall s…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 og 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |