Внутриберибиальная инъекция клеток остеосаркомы для создания ортотопических моделей мышиной остеосаркомы и метастазов в легкие
Summary
Настоящий протокол описывает интратибию остеосаркомы для генерации мышиных моделей, несущих ортотопическую остеосаркому и поражения легочными метастазами.
Abstract
Остеосаркома является наиболее распространенным первичным раком кости у детей и подростков, причем легкие являются наиболее распространенным метастатическим участком. Пятилетняя выживаемость больных остеосаркомой с легочными метастазами составляет менее 30%. Поэтому использование мышиных моделей, имитирующих развитие остеосаркомы у людей, имеет большое значение для понимания фундаментального механизма канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов для разработки новых терапевтических средств. Здесь сообщается о подробных процедурах для создания моделей первичной остеосаркомы и легочных метастазов мыши путем инъекции интратибии клеток остеосаркомы. В сочетании с биолюминесценцией или рентгеновской системой визуализации в реальном времени эти живые мышиные модели используются для мониторинга и количественной оценки роста и метастазирования остеосаркомы. Чтобы установить эту модель, базальную мембранную матрицу, содержащую клетки остеосаркомы, загружали в микрообъемный шприц и вводили в одну большеберцовую кость каждой атипичной мыши после анестезии. Мышей приносили в жертву, когда первичная остеосаркома достигла ограничения размера в одобренном IACUC протоколе. Ноги, несущие остеосаркому, и легкие с метастазирующими поражениями были разделены. Эти модели характеризуются коротким инкубационным периодом, быстрым ростом, тяжелыми поражениями, а также чувствительностью при мониторинге развития первичных и легочных метастатических поражений. Таким образом, это идеальные модели для изучения функций и механизмов специфических факторов канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов, микроокружения опухоли и оценки терапевтической эффективности in vivo.
Introduction
Остеосаркома является наиболее распространенным первичным раком кости у детей и подростков 1,2, который в основном проникает в окружающие ткани и даже метастазирует в легкие при постановке диагноза пациентам. Легочное метастазирование является основной проблемой для терапии остеосаркомы, а пятилетняя выживаемость пациентов с остеосаркомой с легочным метастазированием остается на уровне 20%-30%3,4,5. Тем не менее, пятилетняя выживаемость первичной остеосаркомы была увеличена примерно до 70% с 1970-х годов из-за введения химиотерапии6. Поэтому крайне необходимо понять фундаментальный механизм канцерогенеза остеосаркомы и легочных метастазов для разработки новых методов лечения. Применение мышиных моделей, которые лучше всего имитируют прогрессирование остеосаркомы у людей, имеет большое значение7.
Животные модели остеосаркомы генерируются спонтанной, индуцированной генной инженерией, трансплантацией и другими методами. Модель спонтанной остеосаркомы редко используется из-за длительного времени образования опухоли, непоследовательной частоты возникновения опухоли, низкой заболеваемости и плохой стабильности 8,9. Хотя модель индуцированной остеосаркомы более доступна для получения, чем спонтанная остеосаркома, применение модели индуцированной остеосаркомы ограничено, поскольку индуцирующий фактор будет влиять на микроокружение, патогенез и патологические характеристики остеосаркомы10. Трансгенные модели помогают понять патогенез раковых заболеваний, поскольку они могут лучше имитировать физиологическую и патологическую среду человека; однако трансгенные модели животных также имеют свои ограничения из-за сложности, долгосрочности и высокой стоимости трансгенной модификации. Более того, даже в наиболее широко распространенных трансгенных моделях животных, генерируемых модификацией генов p53 и Rb, только 13,6% саркомы произошло в четырех костях конечностей11,12.
Трансплантация является одним из наиболее часто используемых первичных и отдаленных методов производства модели метастатического рака в последние годы из-за ее простого маневра, стабильной скорости образования опухоли и лучшей однородности13. Трансплантация включает в себя гетеротопную трансплантацию и ортотопическую трансплантацию в соответствии с местами трансплантации. При гетеротопной трансплантации остеосаркомы клетки остеосаркомы вводят вне первичных участков остеосаркомы (кости) животных, обычно под кожу, подкожно14. Хотя гетеротопная трансплантация проста без необходимости выполнения операции у животных, участки, где вводятся клетки остеосаркомы, не представляют собой фактическую микросреду остеосаркомы человека. Ортотопическая трансплантация остеосаркомы – это когда клетки остеосаркомы вводятся в кости животных, такие как большеберцоваякость 15,16. По сравнению с гетеротопными трансплантатами ортотопические трансплантаты остеосаркомы характеризуются коротким инкубационным периодом, быстрым ростом и сильным эрозионным характером; поэтому они являются идеальными животными моделями для исследований, связанных с остеосаркомой17.
Наиболее часто используемыми животными являются мыши, собаки и рыбки данио18,19. Спонтанная модель остеосаркомы обычно используется у собак, потому что остеосаркома является одной из наиболее распространенных опухолей у собак. Однако применение этой модели ограничено из-за длительного времени образования опухоли, низкой скорости опухолевого генеза, плохой однородности и стабильности. Рыбки данио часто используются для построения трансгенных или нокаутирующих опухолевых моделей из-за их быстрого размножения20. Но гены рыбок данио отличаются от генов человека, поэтому их применение ограничено.
В этой работе описываются подробные процедуры, меры предосторожности и репрезентативные изображения для получения первичной остеосаркомы в большеберцовой кости с легочным метастазированием путем инъекции интратибии клеток остеосаркомы у атимических мышей. Этот метод был применен для создания первичной остеосаркомы у голени мыши для оценки терапевтической эффективности, которая показала высокую воспроизводимость21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ортотопическая инъекция клеток остеосаркомы является идеальной моделью для изучения функции и механизма специфических факторов канцерогенеза остеосаркомы и развития для оценки терапевтической эффективности. Чтобы избежать различий в росте опухоли, наиболее активные клетки остеос?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами (1) Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2018YFC1704300 и 2020YFE0201600), (2) Национального фонда наук о природе (81973877 и 82174408).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
References
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
- Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
- Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
- Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
- Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
- Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
- Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
- Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
- Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
- Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
- Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing’s sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
- Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
- Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
- Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
