多发性骨髓瘤骨髓涂片的相间荧光 原位 杂交
Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于提高相间荧光 原位 杂交检测对多发性骨髓瘤患者骨髓涂片的成功率。
Abstract
荧光 原位 杂交（FISH）检测是多发性骨髓瘤（MM）遗传风险分层中不可或缺的方法，MM是最常见的血液系统恶性肿瘤之一。MM的识别特征是骨髓中积聚的恶性浆细胞。MM的FISH报告主要关注纯化或鉴定的克隆浆细胞，而不是所有有核细胞，通过用抗CD138磁珠分选或用细胞质免疫球蛋白轻链κ或λ标记。骨髓间期核通常从新鲜的骨髓细胞中获得。然而，浆细胞标本的令人满意的富集需要大量的新鲜肝素抗凝骨髓，这在骨髓提取困难或骨髓干抽取的情况下无法获得。在本文中，我们建立了一种新颖的方法，以提高对染色或未染色的骨髓涂片进行FISH检测的成功率。骨髓涂片比抗凝骨髓标本更容易获得。
Introduction
多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞（PC）疾病，具有很强的生物学异质性和临床疗效的个体差异，生存期从数月到数十年不等。细胞遗传学特征是MM的重要预后指标。基于遗传特征的风险分层系统和个体化治疗已成为MM1临床研究中备受关注的话题。在骨髓（BM） 荧光原位 杂交（FISH）面板中测试的PC的像差包括del 13q14（RB1），del 17p13（TP53），t（4;14）（IGH / FGFR3），t（11;14）（IGH / MYEOV），t（14;16）（IGH / MAF），t（14：20）（IGH / MAFB），1q21（CKS1B）增益/扩增和1p（CDKN2C）缺失。
在 MM 患者的初始评估中应包括标准的中期细胞遗传学。虽然传统的G带核型分析具有全染色体分析的优势，但该方法的低产量导致许多假阴性结果2。传统上，PC被认为在很大程度上无法分裂，因为它们是B淋巴细胞分化的终末期产物。这使得很难获得分割图像。通过长期培养（6 天）改进 MM 的细胞遗传学分析以及通过细胞因子刺激培养物可能是识别新诊断 MM 患者细胞遗传学异常的有希望的方法3。然而，即使将培养时间延长至6天，30%-50%的MM患者也准确报告了细胞遗传学异常4。此外，MM的特征在于复杂的细胞遗传学畸变，反映了其预后异质性。然而，传统染色体条带技术的分辨率较低，这很容易导致MM染色体异常的检测失误。
相间FISH，优选在CD138阳性磁珠基PC分选或用细胞质免疫球蛋白轻链κ/λ标记后，在MM5，6的分析中是必不可少的。强烈建议选择CD138阳性样品以优化肿瘤细胞的产量。然而，细胞遗传学畸变的准确定量需要至少 4 mL 抗凝 BM 进行 PC 分选。此外，CD138免疫磁珠分选与FISH或细胞质κ / λ轻链免疫球蛋白与FISH测试（cIg-FISH）的组合增加了许多实验成本并且非常耗时。
通常，PC比率首先通过染色的BM涂片或BM活检部分的形态学检查来评估7，8。最高质量的BM样本（第一个骨髓抽吸样本）用于形态学测试，而那些送去FISH或其他检测的标本通常是与外周血稀释比例高的二级抽吸物样本。
早在20世纪90年代，多项研究表明，BM涂片可以直接用于间质FISH检查，这已被证明是一种可靠且可重复的方法9。一项基于细胞形态学和酯酶细胞化学结合外周血FISH和BM涂片的优雅研究证实了其对阐明粒细胞和淋巴细胞白血病患者染色体异常的巨大临床意义10。
本文为提高MM患者相间FISH检测的成功率提供了一种新颖的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
FISH在MM的遗传风险分层中的应用至关重要。FISH报告的关键部分不是所有有核细胞，而是通过用抗CD138磁珠分选或用细胞质免疫球蛋白轻链κ或λ标记特异性纯化或鉴定的克隆PC。PC分选或cIg-FISH后的相间FISH在MM的诊断中具有显着意义，因为BM中PC的比例相对较低。然而，这些方法存在一些缺点，包括工艺复杂，样品要求高，实验成本高。50台PC可以通过显微镜级游标卡尺快速定位。BM 涂片比抗凝剂 BM 标…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目由WNLO 2018WNLOKF023创新基金支持。
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
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