多発性骨髄腫の骨髄塗抹標本の その場での 相間蛍光ハイブリダイゼーション
Summary
ここでは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄塗抹標本に対する相間蛍光 in situ ハイブリダイゼーション検出の成功を改善するためのプロトコールを提示する。
Abstract
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)検出は、最も一般的な血液悪性腫瘍の1つである多発性骨髄腫(MM)における遺伝的リスク層別化に不可欠な方法である。MMの同定特徴は、骨髄中に悪性形質細胞が蓄積されたことである。MMに関するFISHの報告は、抗CD138磁気ビーズで選別するか、細胞質免疫グロブリン軽鎖κまたはλでマーキングすることによって、すべての有核細胞ではなく、精製または同定されたクローン形質細胞に主に焦点を当てています。骨髄間相核は、通常、新鮮な骨髄細胞から得られる。しかし、形質細胞検体の十分な濃縮には、大量の新鮮なヘパリン抗凝固骨髄が必要であり、これは困難な骨髄抽出や骨髄ドライタップの場合には得られない。本明細書では、染色または未染色の骨髄塗抹標本に対するFISH検出の成功を改善するための新規な方法を確立する。骨髄塗抹標本は、抗凝固骨髄標本よりも入手が容易である。
Introduction
多発性骨髄腫(MM)は、強い生物学的不均一性と臨床的有効性の大きな個人差を有する悪性形質細胞(PC)疾患であり、生存期間は数ヶ月から数十年の範囲である。細胞遺伝学的特徴は、MMの重要な予後指標である。リスク層別化システムや遺伝的特徴に基づく個別化治療は、MM1の臨床研究において大きな関心を集めています。骨髄(BM)の蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)パネルで試験されたPCの収差には、del 13q14(RB1)、del 17p13(TP53)、t(4;14)(IGH/FGFR3)、t(11;14)(IGH/MYEOV)、t(14;16)(IGH/MAF)、t(14:20)(IGH/MAFB)、1q21(CKS1B)ゲイン/増幅、および1p(CDKN2C)欠失が含まれる。
標準的な中期細胞遺伝学は、MM患者の初期評価に含めるべきである。従来のGバンド核型解析は全染色体解析の利点を提供しますが、この方法の収率が低いため、多くの偽陰性の結果が得られます2。伝統的に、PCはBリンパ球分化の末期産物であるため、分裂することがほとんどできないと考えられてきました。これにより、分割画像の取得が難しくなります。長期培養(6日間)およびサイトカインによる培養物の刺激によるMMにおける細胞遺伝学的解析の改善は、新たに診断されたMM患者における細胞遺伝学的異常を同定するための有望な方法であり得る3。しかし、培養時間を6日間に延長した場合でも、MM患者の30~50%で細胞遺伝学的異常が正確に報告されました4。さらに、MMは、その予後不均一性を反映する複雑な細胞遺伝学的異常によって特徴付けられる。しかし、従来の染色体バンディング技術の分解能は低く、MMにおける染色体異常の検出を見逃し易くする可能性がある。
間相FISH、好ましくはCD138陽性磁気ビーズベースのPCソーティングまたは細胞質免疫グロブリン軽鎖κ/λによるマーキングの後、MM5,6の分析に不可欠です。CD138陽性の選択されたサンプルは、腫瘍細胞の収量を最適化するために強く推奨される。しかし、細胞遺伝学的異常を正確に定量するには、PCソーティングのために少なくとも4mLの抗凝固BMが必要です。さらに、FISHによるCD138免疫磁気ビーズソーティングまたはFISH検査による細胞質κ/λ軽鎖免疫グロブリン(cIg-FISH)の組み合わせは、多数の実験コストを増加させ、時間がかかります。
通常、PC比は、染色されたBM塗抹標本またはBM生検切片の形態学的検査から最初に評価される7,8。最高品質のBM試料(第1骨髄吸引試料)は形態学的検査に使用されるが、FISHまたは他の検出のために送られたものは、しばしば末梢血との希釈率が高い二次吸引試料である。
早くも1990年代には、BM塗抹標本が間質FISH検査に直接使用できることが複数の研究で示され、信頼性が高く再現性のある方法であることが証明されています9。末梢血のFISHやBM塗抹標本と組み合わせた細胞形態とエステラーゼ細胞化学に基づく優雅な研究は、顆粒球性白血病およびリンパ性白血病患者の染色体異常を解明するための大きな臨床的意義を確認しました10。
本明細書では、MM患者における相間FISH検出の成功を改善するための新規な方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
MMにおける遺伝的リスク層別化へのFISHの適用は不可欠である。FISHレポートの重要な部分は、すべての有核細胞ではなく、抗CD138磁気ビーズで選別するか、細胞質免疫グロブリン軽鎖κまたはλでマーキングすることによって特異的に精製または同定されたクローンPCです。PCソーティングまたはcIg-FISH後の相間FISHは、BM中のPCの割合が比較的低いため、MMの診断において有意であることが判明し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、WNLO 2018WNLOKF023のイノベーション基金の支援を受けました。
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
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