다발성 골수종의 골수 얼룩의 계내 형광 혼성화
Summary
여기에서, 우리는 다발성 골수종 환자로부터의 골수 도말에 대한 계내 혼성화 검출에서 위상간 형광의 성공을 개선하기 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
형광 계내 혼성화 (FISH) 검출은 가장 흔한 혈액학적 악성 종양 중 하나인 다발성 골수종 (MM)의 유전 적 위험 계층화에 없어서는 안될 방법입니다. MM의 식별 특성은 골수에 악성 혈장 세포가 축적되어 있다는 것이다. MM에 대한 FISH 보고서는 항-CD138 자기 비드로 분류하거나 세포질 면역 글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 모든 유핵 세포보다는 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포에 주로 초점을 맞춥니다. 골수 간 상 핵은 일반적으로 신선한 골수 세포로부터 얻어집니다. 그러나, 혈장 세포 표본의 만족스러운 농축은 다량의 신선한 헤파린 항응고 골수를 필요로 하며, 이는 어려운 골수 추출 또는 골수 건조 탭의 경우에는 얻을 수 없다. 여기에서, 우리는 염색 또는 염색되지 않은 골수 도말에 대한 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 새로운 방법을 확립한다. 골수 얼룩은 항응고 된 골수 표본보다 쉽게 얻을 수 있습니다.
Introduction
다발성 골수종 (MM)은 생물학적 이질성이 강하고 임상 효능이 큰 개인차를 가진 악성 혈장 세포 (PC) 질환으로 생존 기간은 수개월에서 수십 년 사이입니다. 세포유전학적 특성은 MM의 중요한 예후 지표이다. 위험 계층화 시스템과 유전 적 특성에 기반한 개별화 된 치료법은 MM1에 대한 임상 연구에 대한 강렬한 관심의 주제가되었습니다. 골수 (BM)의 형광 계내 혼성화 (FISH) 패널에서 테스트 된 PC의 수차에는 del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14;16) (IGH / MAF), t (14 : 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) 이득 / 증폭 및 1p (CDKN2C) 결실이 포함됩니다.
표준 형이상상 세포유전학은 MM 환자의 초기 평가에 포함되어야 한다. 기존의 G 밴드 핵형이 전체 염색체 분석의 이점을 제공하지만,이 방법의 낮은 수율은 많은 위음성 결과를 초래합니다2. 전통적으로, PC는 B 림프구 분화의 최종 단계 생성물이기 때문에 분할이 불가능한 것으로 간주되어 왔다. 이로 인해 분할 이미지를 얻기가 어렵습니다. 장기 배양(6일)을 통한 MM에서의 개선된 세포유전학적 분석 및 사이토카인에 의한 배양의 자극은 새로 진단된 MM 환자에서 세포유전학적 이상을 확인하기 위한 유망한 방법일 수 있다3. 그러나 배양 시간이 6일로 연장되었을 때조차도, 세포유전학적 이상은 MM 환자의 30%-50%에서 정확하게 보고되었다4. 또한, MM은 그의 예후 이질성을 반영하는 복잡한 세포유전학적 수차를 특징으로 한다. 그러나 전통적인 염색체 밴딩 기술의 해상도가 낮기 때문에 MM에서 염색체 이상을 쉽게 탐지하지 못할 수 있습니다.
세포질 면역글로불린 경쇄 κ/λ로 CD138 양성 자기 비드 기반 PC 분류 또는 마킹 후, 바람직하게는 상간 FISH는 MM5,6의 분석에 없어서는 안 될 필수 요소이다. CD138 양성 선별 샘플은 종양 세포의 최적화된 수율을 위해 강력하게 권장된다. 그러나, 세포유전학적 수차의 정확한 정량화는 PC 분류를 위해 적어도 4mL의 항응고된 BM을 필요로 한다. 또한, CD138 면역자기 비드 분류와 FISH 또는 세포질 κ/λ 경쇄 면역글로불린과 FISH 테스트(cIg-FISH)의 조합은 수많은 실험 비용을 증가시키고 시간이 많이 걸립니다.
보통, PC 비율은 염색된 BM 도말 또는 BM 생검 섹션7,8의 형태학적 검사로부터 먼저 평가된다. 최고 품질의 BM 표본 (첫 번째 골수 흡인물 샘플)은 형태 학적 테스트에 사용되는 반면, FISH 또는 기타 검출을 위해 보내진 샘플은 종종 말초 혈액으로 희석 비율이 높은 보조 흡인물 샘플입니다.
1990년대 초, 여러 연구에 따르면 BM 도말들은 간질성 FISH 검사에 직접 사용될 수 있으며, 이는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법인 것으로 입증되었습니다9. 말초 혈액 및 BM 도말의 FISH와 결합 된 세포 형태학 및 에스테라제 세포 화학에 기초한 우아한 연구는 과립 및 림프구성 백혈병 환자의 염색체 이상을 밝히는 데 큰 임상 적 중요성을 확인했습니다10.
본원에서, 우리는 MM 환자에서 상간 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MM에서 유전 적 위험 계층화에 FISH를 적용하는 것이 필수적입니다. FISH 보고의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라, 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 면역글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 PC이다. PC 분류 후 상간 FISH 또는 cIg-FISH는 BM에서 PC의 상대적으로 낮은 비율로 인해 MM의 진단에 유의한 것으로 밝혀졌다. 그러나 이러한 방법에는 복잡?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 WNLO 2018WNLOKF023의 혁신 기금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
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