En ikke-mærket, ikke-radio-isotopisk metode til assay uracil-DNA-glycosylaseaktivitet blev udviklet ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri til direkte apurinisk/ apyrimidinisk stedholdig produktanalyse. Assayet viste sig at være ret simpelt, specifikt, hurtigt og let at bruge til DNA-glycosylasemåling.
Uracil-DNA-glycosylase (UDG) er en nøglekomponent i baseudskæringsreparationsvejen til korrektion af uracil dannet ved hydrolytisk deaminering af cytosin. Det er således afgørende for vedligeholdelse af genomintegritet. En meget specifik, ikke-mærket, ikke-radio-isotopisk metode blev udviklet til at måle UDG-aktivitet. En syntetisk DNA-duplex indeholdende en stedsspecifik uracil blev spaltet af UDG og derefter underkastet Matrix-assisteret laserdesorption/ioniseringstid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse. En protokol blev etableret for at bevare det apuriniske / apyrimidiniske sted (AP) produkt i DNA uden strengbrud. Ændringen i m/z-værdien fra substratet til produktet blev anvendt til at evaluere uracilhydrolyse ved UDG. Et G: U-substrat blev anvendt til UDG-kinetisk analyse, der gav Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM / s og Kcat = 9,31 s-1. Anvendelse af denne metode på en uracil glycosylasehæmmer (UGI) assay gav en IC50-værdi på 7,6 pM. UDG-specificiteten ved anvendelse af uracil på forskellige positioner inden for enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA-substrater viste forskellige spaltningseffektiviteter. Således kan denne enkle, hurtige og alsidige MALDI-TOF MS-metode være en glimrende referencemetode til forskellige monofunktionelle DNA-glycosylaser. Det har også potentialet som et redskab til SCREENING AF DNA-glycosylasehæmmere.
Selvom uracil er en normal base i RNA, er det en almindelig og meget mutagent læsion i genomisk DNA. Uracil kan opstå ved spontan/enzymatisk hydrolytisk deaminering af en deoxycytidin. I hver levende celle forekommer denne deaminering 100-500 gange om dagen under fysiologiske forhold1,2. Hvis disse ændringer ikke repareres, kan der være en ændring i DNA-sekvenssammensætningen, hvilket forårsager mutation. Da uracil i DNA foretrækker at parre sig med dATP under replikation, hvis cytosin deaminerer til uracil, vil der i to replikationshændelser være en ny G: C til A: T overgangsmutation i halvdelen af afkom DNA3.
Blandt de cellulære strategier til opretholdelse af genetisk stabilitet er base excision repair (BER) en væsentlig mekanisme, der reparerer beskadigede baser, såsom uracil, i DNA4. BER er en meget evolutionært bevaret proces. Der er to generelle BER-veje: den korte patchvej, der fører til en reparationskanal af et enkelt nukleotid, og den lange patchvej, der producerer en reparationskanal på mindst to nukleotider5. BER er en koordineret mekanisme, der forekommer i flere trin. Det første trin i BER er den enzymatiske hydrolyse af den beskadigede nukleotidbase ved hjælp af en skadesspecifik DNA-glycosylase for at generere et apurinisk/apyrimidinisk (AP) mellemliggende sted6. Dette efterfølges af spaltningen af sukkerfosfatrygraden på AP-stedet af en endonuklease, oprydning af DNA-enderne med en lyase, gap-fyldning af en DNA-polymerase og forsegling af det endelige nick med en ligase5.
Uracil-DNA-glycosylase (UDG) hydrolyserer uracil fra uracilholdigt DNA til BER i Escherichia coli. Konventionelle UDG-assays ved hjælp af radioaktivt mærket DNA, der involverer forskellige separationsteknikker6,7,8,9,10,11,12,13, er normalt tidskrævende, arbejdskrævende, med dyre mærkningsreagenser, komplicerede procedurer og kræver intensiv træning og praksis for at reducere risikoen for eksponering for radioaktive materialer. Fluorometriske oligonukleotidassays er udviklet som erstatning for radioisotopmærkning14, ud over molekylære fyrtårne og Förster resonansenergioverførselsteknologi15,16,17,18,19,20. Der kræves dog specifik mærkning for alle ovennævnte metoder. For nylig er der udviklet etiketfrie biosensorer assays21,22,23 og kolorimetriske metoder baseret på dannelsen af en G-quadruplex24,25,26. Imidlertid komplicerer flere A: U-par eller specielt designede sekvenser i sonderne enzymenhedsdefinitionen.
MALDI-TOF MS er en teknologi, der kan være til stor nytte i DNA-analyse. Udviklede anvendelser omfatter enkeltnukleotidpolymorfisme genotyping27,28, modificeret nukleotidanalyse29 og DNA-reparation mellemidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS bør let anvendes til DNA-glycosylaseanalyse til påvisning af AP-site-holdige DNA-produkter. AP-steder i DNA er imidlertid tilbøjelige til at bryde streng under mange eksperimentelle forhold33. Et UDG-assay præsenteres her ved hjælp af MALDI-TOF MS til direkte måling af AP-produktionsstedet uden betydelig strengbrudsstøj. Denne etiketfri metode er let at arbejde med og har et stort potentiale for farmaceutisk anvendelse af DNA-glycosylasehæmmerscreening.
Dette papir indeholder en detaljeret procedure for anvendelse af en UDG MALDI-TOF MS-analysemetode til direkte påvisning af AP-holdige DNA-produkter. De vigtigste fordele ved denne metode er, at uracilholdige substrater er etiketfrie, skalerbare, nemme at arbejde med og giver større fleksibilitet i substratdesign.
Den UDG-leverandøranbefalede phenol/chloroformekstraktion muliggør inaktivering af enzymet for at forhindre nedbrydning af produkt-DNA. Phenolekstraktionsprotokollen involverer i…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) og NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan, R.O.C. [tilskudsnummer MOST109-2314-B-002 -186 til K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 til S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 til W.-h.F.]. H.-L.C. er modtager af et ph.d.-stipendium fra National Taiwan University. Finansiering af open access-afgift: Ministeriet for Videnskab og Teknologi, R.O.C.
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |