우라실-DNA 글리코실라제 활성을 분석하기 위한 비표지, 비-방사성-동위원소 방법은 직접 아푸린산/아피리미딘 부위 함유 생성물 분석을 위해 MALDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 개발되었다. 이 분석은 DNA 글리코실라제 측정에 매우 간단하고, 구체적이며, 빠르고, 사용하기 쉬운 것으로 판명되었습니다.
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방법 논문
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광법 분석에 의한 우라실-DNA 글리코실라제 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 시토신의 가수분해 탈아민화로부터 형성된 우라실의 교정을 위한 염기 절제 복구 경로의 핵심 성분이다. 따라서 게놈 무결성 유지에 중요합니다. UDG 활성을 측정하기 위해 매우 특이적이고 라벨링되지 않은 비방사성 동위원소 방법이 개발되었다. 부위 특이적 우라실을 함유하는 합성 DNA 듀플렉스를 UDG에 의해 절단한 다음, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광분석법(MALDI-TOF MS) 분석을 실시하였다. 가닥 파괴 없이 DNA에서 아푸린산/아피리미딘 부위(AP) 생성물을 보존하기 위한 프로토콜이 확립되었다. 기질에서 생성물로의 m/z 값의 변화는 UDG에 의한 우라실 가수분해를 평가하기 위해 사용되었다. UDG 동역학 분석에 G:U 기질을 사용하여 Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s 및 Kcat = 9.31 s-1을 산출하였다. 이 방법을 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 분석법에 적용하면 7.6 pM의 IC50 값이 산출되었다. 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 기질 내의 다양한 위치에서 우라실을 사용한 UDG 특이성은 상이한 절단 효율을 입증하였다. 따라서, 이러한 간단하고, 신속하고, 다재다능한 MALDI-TOF MS 방법은 다양한 단기능 DNA 글리코실라제에 대한 우수한 참조 방법이 될 수 있었다. 또한 DNA 글리코실라제 억제제 스크리닝을 위한 도구로서의 잠재력을 갖는다.
서론
우라실은 RNA에서 정상적인 염기이지만, 게놈 DNA에서 흔하고 고도로 돌연변이 유발 병변입니다. 우라실은 데옥시시티딘의 자발적/효소적 가수분해 탈아민화로부터 발생할 수 있다. 각 살아있는 세포에서,이 탈아민화는 생리 학적 조건 하에서 하루에 100-500 번 발생합니다1,2. 이러한 변화가 복구되지 않으면 DNA 서열 조성에 변화가 생겨 돌연변이를 일으킬 수 있습니다. DNA의 우라실이 복제 중에 dATP와 쌍을 이루는 것을 선호하기 때문에, 시토신이 우라실로 deaminates되면, 두 개의 복제 이벤트에서, 자손 DNA3의 절반에서 새로운 G:C에서 A:T 전이 돌연변이가 있을 것이다.
유전 적 안정성을 유지하기위한 세포 전략 중 염기 절제 복구 (BER)는 DNA4에서 우라실과 같은 손상된 염기를 복구하는 필수 메커니즘입니다. BER은 고도로 진화적으로 보존된 과정이다. 두 개의 일반적인 BER 경로가 있습니다 : 단일 뉴클레오티드의 복구 관으로 이어지는 짧은 패치 경로와 적어도 두 뉴클레오티드의 복구 관을 생성하는 긴 패치 경로
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프로토콜
1. 기판/템플릿 준비
- 듀플렉스 영역에 대해 ~50 ± 10%의 균형 잡힌 G+C 함량과 50°C의 최소 용융 온도로 우라실 기판/템플릿 듀플렉스를 설계하십시오.
참고: 18 nt 기질과 19 nt 주형(표 1 및 그림 1) 사이의 한 뉴클레오티드 차이는 MS 신호 해석 및 적절한 어닐링을 개선하는 데 도움이 됩니다. 주형 가닥은 A-U 또는 G-U 미스매치를 생성하는 상보적 DNA로서 기능하지만(표 1), MS 측정에서 기준 신호로서 사용될 수도 있다. HPLC-정제된 합성 올리고뉴클레오티드의 사용은 본 연구에 만족한다. - DNA를 스톡으로서 100 μmol/L의 농도로 1 mM EDTA 및 10 mM Tris-HCl (25°C에서 pH 8.0) (TE)에 용해시키고 -20°C에서 저장한다. 이 20μL 스톡을 TE로 희석하여 최종 부피 800μL(4μmol/L로 25배 희석)로 희석합니다. λ = 260 nm의 UV 가시 분광 광도계에서 DNA 용액의 흡광도를 측정하여 제조업체가 할당 한 농도를 확인하십시오. 예: U+9의 4μmol/L에 대해 A260 = 0.204, T1의 4μmol/L에 대해 A260....
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결과
템플릿 및 기판
예를 들어 G 주형과 짝을 이룬 중앙(U+9)에 U를 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 취하면(그림 1A), 등몰량의 주형 및 우라실 함유 기질의 블랭크 조절을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드 순도의 품질 관리를 할 수 있습니다(그림 1B; 신호는 지정된 m/z 및 낮은 배경 잡음과 일치합니다). MS 데이터 분석을 위해, 피크 높이를 측정하였다(도 2). 19 nt 주형 DNA는 글리코실라제 가수분해 후에 변하지 않은 채로 남아있을 것으로 예상되었다; 따라서, 신호는 AP-생성물의 정량화를 위한 기준 역할을 할 수 있다(그림 1C).
반응 조건 및 질량 스펙트럼
이러한 DNA 글리코실.......
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토론
이 논문은 UDG MALDI-TOF MS 분석 방법을 사용하여 AP 함유 DNA 생성물을 직접 검출하기 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 방법의 주요 장점은 우라실 함유 기판이 라벨이 없고 확장 가능하며 작업하기 쉽고 기판 설계에 더 큰 유연성을 제공한다는 것입니다.
UDG 공급업체가 권장하는 페놀/클로로포름 추출은 효소의 불활성화를 가능하게 하여 생성물 DNA의 분해를 방지합니다. 그러나 페놀 추출 프로토콜은 유해 화학 물질의 지루한 상 분리를 포함합니다. 반응 pH를 2 내지 0.5로 낮추기 위해 HCl을 사용하는 대안적인 산 종결 방법도 UDG±를 효과적으로 불활성화시켰다. 트리스 염기를 사용한 후속 중화는 DNA 손상을 예방할 수 있었다. AP 생성물이 30시간 이내에 MS 분석을 실시했을 때, 질량 스펙트럼에서 염기 손실 또는 변형의 징후는 없었다(도 1E). 반응에서 트리스 완충제를 상용 UDG와 함께 제공하였다. .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (대만 타이페이)와 NRPB Pharmacogenomics Lab (대만 타이페이)의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 대만 R.O..C 과학 기술부에서 지원했습니다. [허가 번호 MOST109-2314-B-002 -186 to K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 to S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 to W.-h.F.]. H.-L.C.는 국립 대만 대학에서 박사 학위 펠로우십을 받았습니다. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : 과학 기술부, R.O.C.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| 오토클레이브 탈이온수 | MILLIPORE | 프로토콜 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | 프로토콜 1,2 | |
| 장갑 | AQUAGLOVE | 프로토콜 1,2,3 | |
| 염산(HCl) | SIGMA | 프로토콜 1,2 | |
| 얼음 양동이 | Taiwan.Inc | 프로토콜 2 | |
| 저 보유 피펫 팁 (0.5-10 µ L) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention 피펫 팁(1,250 µ L) | 국가 과학 공급 공동, Inc. | 프로토콜 1,2 | |
| Low retention 피펫 팁(200 µ L) | 국가 과학 공급 공동, Inc. | 프로토콜 1,2 | |
| MassARRAY& | nbsp; Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 질량 분석 제어 프로그램에는 Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE 및 Start RT Process가 포함됩니다. | |
| MassARRAY 나노 디스펜서 | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | 프로토콜 3 |
| 마이크로 원심분리기 | Kubota | 프로토콜 2 | |
| 마이크로 원심분리기 | Clubio | 프로토콜 2 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | 프로토콜 2 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 랙 | Taiwan.Inc | 프로토콜 1,2 | |
| 마이크로피펫 (P1000) | Gilson | 프로토콜 1,2 | |
| 마이크로피펫 (2쪽) | Gilson | 프로토콜 1,2 | |
| 마이크로피펫(P10) | Gilson | 프로토콜 1,2 | |
| 마이크로피펫(P100) | Gilson | 프로토콜 1,2 | |
| 마이크로피펫(P200) | Gilson | 프로토콜 1,2 | |
| 마이크로피펫(SL2) | Rainin | 프로토콜 1,2 | |
| 올리고뉴클레오티드 | 통합 DNA 기술(싱가포르) | 프로토콜 1,2 | |
| 퀘스트 그래프 IC50 계산기 (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | 그림 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 | |
| 수산화나트륨(NaOH) | WAKO | 프로토콜 2 | |
| SpectroCHIP 어레이 | Agena Bioscience, CA | #01509 | 프로토콜 3, 5 |
| 타이머 | Taiwan.Inc | 프로토콜 2 | |
| Typer 4.0 소프트웨어 | Agena Bioscience, CA | #10145 | 프로토콜 6 Typer 4.0은 Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor 및 Typer Analyzer의 4가지 프로그램으로 구성되어 있습니다. |
| UDG 반응 완충액 (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | 프로토콜 2 |
| 우라실 글리코실라제 억제제 | New England Biolabs, MA | M0281S | 프로토콜 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | 프로토콜 2 |
| UV-VISBLE 분광 광도계 UV-1601 | SHIMADZU | 프로토콜 1 | |
| 수조 | ZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc) | 프로토콜 2 |
참고문헌
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E.
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재인쇄 및 허가
