בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים
Summary
מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.
Abstract
נדידת תאים ופלישה הם סימני היכר ספציפיים של גידולים מוטנטיים מסוג Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M. כבר מידלנו תכונות אלה באמצעות מבחני פלישה והגירה תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבוססי תאים. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של מבחני תלת-ממד אלה עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים. מגיב תיוג נוגדנים שימש כדי לזהות בזמן אמת את הביטוי של מולקולת ההידבקות CD44, על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים של קו תאים ראשוני שמקורו בחולה DMG H3K27M. CD44 קשור לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידה ופלישה של תאי גידול והוא מעורב באינטראקציות ישירות עם המטריצה החוץ תאית של מערכת העצבים המרכזית (CNS). נוירוספרות (NS) מקו התאים DMG H3K27M הוטמעו במטריצת קרום הבסיס (BMM) או הונחו על שכבת ציפוי דקה של BMM, בנוכחות נוגדן אנטי-CD44 בשילוב עם מגיב תיוג נוגדנים (ALR). ניתוח התמונה האימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד בוצע על מכשיר ניתוח תאים חיים כדי למדוד כמותית את ביטוי CD44 הכולל, במיוחד על התאים הנודדים והפולשים. השיטה מאפשרת גם הדמיה בזמן אמת של ביטוי לסירוגין של CD44 על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים. יתר על כן, הבדיקה גם סיפקה תובנות חדשות לגבי התפקיד הפוטנציאלי של CD44 במעבר מזנכימלי לאמבואיד בתאי DMG H3K27M.
Introduction
היכולת של תאי הגידול להתחמק ולהתפשט דרך הרקמה שמסביב היא סימן ההיכר של סרטן1. בפרט, תנועתיות תאי הגידול היא מאפיין אופייני של גידולים ממאירים, בין אם מדובר בסוג גידול גרורתי כגון שד2 או סרטן המעי הגס3 או מסוג פולשני מקומי כגון גליומה מפושטת 4,5.
לדימות תפקיד מרכזי בחקירת היבטים רבים של פנוטיפים של תאי גידול; עם זאת, הדמיה של תאים חיים בהחלט עדיפה כאשר חוקרים תהליכים תאיים דינמיים כגון נדידה ופלישה, כאשר שינויים במורפולוגיה ובאינטראקציה בין תאים 6,7 מתרחשים וניתן לבחון אותם בקלות רבה יותר לאורך זמן. לצורך דימות תאים חיים ניתן להשתמש במערכות מיקרוסקופיה אופטיות שונות, החל מניגוד פאזה ועד מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקליים, וקליטת תמונה המבוצעת על פני פרק זמן קצר או ארוך במיקרוסקופ הפוך המצויד בתא לבקרת טמפרטורהו-CO2, או במערכות ניתוח תמונה בעלות תוכן גבוה בעלות תאים מובנים, או לחילופין במערכות תמונה המסוגלות לשבת באינקובטור ללא צורך להפריע לתאים לאורך כל הזמן של הניסוי. בחירת המערכת בה נעשה שימוש מוכתבת לעיתים קרובות על ידי מספר גורמים כגון הרזולוציה הדרושה, אורך זמן הרכישה הכולל ומרווחי הזמן, סוג כלי הדם המשמש והתפוקה של הבדיקה (תא בודד או צלחת מרובת בארות), רגישות התאים המשמשים (תאים יקרים ו / או נדירים) ופוטוטוקסיות של התאים אם קיימים פלואורופורים.
באשר לדימות פלואורסצנטי במצב חי, ניתן להשיג זאת על ידי התמרת תאים לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים או לביטוי יציב או כמערכת אינדוקציה8, על ידי התמרה של תאים חולפים, או על ידי שימוש בצבעי תאים הזמינים כעת לסימון תאים חיים7, למעקב אחר תאים חיים וכן לתיוג אברונים תת-תאיים9.
לאחרונה פותחה גישה שימושית לאימונוציטוכימיה של תאים חיים, שבה נוגדן המזהה סמן פני שטח נבחר יכול להיות קשור למגיב תיוג, ובתוספת מדיה תרבית, תאים המבטאים את הסמן הספציפי יכולים להיות מצולמים בקלות בזמן אמת על ידי הדמיה של תאים חיים. הדמיה וכימות של ביטוי סמן באמצעות מערכת כזו ניתן להשיג בקלות כאשר תאים גדלים בתנאי תרבית דו-ממדית (2D)10.
במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולים לפלישה אימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד והגירה של תאים שמקורם בגליומה מפושטת בקו האמצע בילדים (DMG)11,12. DMG הם גידולי מוח אגרסיביים מאוד הפוגעים בילדים, עבור רובם המכריע הקשורים למוטציה המניע K27M בגרסאות היסטון H3. DMG מתעוררים בגזע המוח ובאזורי קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומאופיינים באופי חדיר מאוד. יכולת פולשנית זו הוכחה כמתווכת לפחות בחלקה על ידי ההטרוגניות התוך-סרטנית והתכונות דמויות-הגזע הסרטני של תאי DMG7.
כדי להדגים את הבדיקות שלנו, נעשה שימוש בריאגנט תיוג נוגדנים (ALR) בשילוב עם נוגדן עבור CD44. CD44 הוא גליקופרוטאין טרנסממברנה ומולקולת היצמדות המתבטאת בתאי גזע ובסוגי תאים אחרים, הקשורים לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידת תאי גידול ופלישה13. הפרוטוקולים כוללים את הכנת הדגימה, רכישת התמונה במצב שדה בהיר ופלואורסצנטי, והניתוח על מכשיר ניתוח תאים חיים שאיפשר למדוד כמותית בזמן אמת את ביטוי CD44 הכולל על קרום תא DMG במהלך פלישה והגירה תלת-ממדית. הבדיקות אפשרו גם את האפשרות לדמיין את האות הפלואורסצנטי לסירוגין של CD44 על תאים בודדים בזמן נדידה ופלישה. מעניין לציין כי נצפתה גם השפעה של נוגדן אנטי-CD44, אשר עשוי לפעול כנוגדן חוסם, נראה גם להפחית נדידת תאים ופלישה, כמו גם לגרום לשינוי של דפוס הפלישה מ mesenchymal קולקטיבי דמוי פנוטיפ דמוי amoeboid תא יחיד יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
האימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים שאימצנו כאן לפלישה והגירה של DMG בילדים יכולה להיות מותאמת בקלות גם לסוגים אחרים של תאי גידול פולשניים מאוד, כולל שורות תאים של סרטן השד והמעי הגס.
בשונה מבדיקות אימונוציטוכימיה של תאים דו-ממדיים חייםשבוצעו בעבר 10, כאשר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר סילביה סודו ולד”ר ג’וליה פדריצ’י (היחידה לרשתות סלולריות ומטרות טיפוליות מולקולריות, המכון הלאומי לסרטן IRCCS-Regina Elena, רומא, איטליה) על הגישה למערכת IncuCyte S3 Live Cell Imaging System בהגדרה הראשונית של פרוטוקול ההדמיה. יתר על כן, אנו מודים לברנדט קולוזווארי על הייעוץ הטכני. המחקר נתמך על ידי מענק ילדים חולי סרטן בבריטניה (16-234) ומשרד הבריאות האיטלקי Ricerca Corrente. M וינצ’י הוא עמית ילדים חולי סרטן בבריטניה. R Ferretti הוא חתן מלגת Fondazione Veronesi (2018 ו 2019). המחברים מודים ל-Fondazione Heal על תמיכתם ולקרן בית החולים לילדים על מימון בנק גידולי הילדים של קווינסלנד.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
