Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Summary

Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.

Abstract

La migración celular y la invasión son características distintivas específicas de los tumores con mutación H3K27M en glioma difuso de línea media (DMG). Ya hemos modelado estas características utilizando ensayos tridimensionales (3D) de invasión y migración basados en células. En este estudio, hemos optimizado estos ensayos 3D para la inmunocitoquímica de células vivas. Se utilizó un reactivo de marcaje de anticuerpos para detectar en tiempo real la expresión de la molécula de adhesión CD44, en la membrana plasmática de células migratorias e invasoras de una línea celular primaria derivada del paciente DMG H3K27M. CD44 se asocia con el fenotipo de las células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales y está involucrado en las interacciones directas con la matriz extracelular del sistema nervioso central (SNC). Las neuroesferas (NS) de la línea celular DMG H3K27M se incrustaron en la matriz de la membrana basal (BMM) o se colocaron sobre una capa delgada de BMM, en presencia de un anticuerpo anti-CD44 junto con el reactivo de marcaje de anticuerpos (ALR). El análisis de imágenes de inmunocitoquímica de células vivas en 3D se realizó en un instrumento de análisis de células vivas para medir cuantitativamente la expresión general de CD44, específicamente en las células migratorias e invasoras. El método también permite visualizar en tiempo real la expresión intermitente de CD44 en la membrana plasmática de las células migratorias e invasoras. Además, el ensayo también proporcionó nuevos conocimientos sobre el papel potencial de CD44 en la transición mesenquimal a ameboide en células DMG H3K27M.

Introduction

La capacidad de las células tumorales para evadir y diseminarse a través del tejido circundante es un sello distintivo^{del cáncer.} En particular, la motilidad de las células tumorales es un rasgo característico de los tumores malignos, ya sea un tipo de tumor metastásico como el cáncer de mama² o colorrectal³ o un tipo localmente invasivo como el glioma difuso ^4,5.

Las imágenes tienen un papel central en la investigación de muchos aspectos de los fenotipos de las células tumorales; Sin embargo, la obtención de imágenes de células vivas es definitivamente preferible cuando se estudian procesos celulares dinámicos como la migración y la invasión, cuando se producen cambios en la morfología y la interacción célula-célula ^6,7 y pueden examinarse más fácilmente a lo largo del tiempo. Para la obtención de imágenes de células vivas, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopía óptica, desde el contraste de fase hasta los microscopios fluorescentes confocal, y la adquisición de imágenes realizada durante un corto o largo período de tiempo en un microscopio invertido equipado con una cámara para el control de la temperatura y el_CO2, o en sistemas de análisis de imágenes de alto contenido que tienen cámaras incorporadas, o alternativamente en sistemas de imágenes que pueden permanecer en la incubadora sin necesidad de perturbar las células durante toda la duración del experimento. La elección del sistema utilizado suele estar dictada por una serie de factores, como la resolución necesaria, la duración del tiempo total de adquisición y los intervalos de tiempo, el tipo de recipiente utilizado y el rendimiento del ensayo (cámara única o placa de pocillos múltiples), la sensibilidad de las células utilizadas (células preciosas y/o raras) y la fototoxicidad de las células si hay fluoróforos presentes.

Con respecto a las imágenes fluorescentes en modo vivo, esto puede lograrse mediante la transducción de células para la expresión de proteínas fluorescentes, ya sea para una expresión estable o como un sistema inducible⁸, mediante la transfección celular transitoria o mediante el uso de colorantes celulares que ahora están disponibles para el marcaje de células vivas⁷, para el seguimiento de células vivas y para el etiquetado de orgánulos subcelulares⁹.

Recientemente se ha desarrollado un enfoque útil para la inmunocitoquímica de células vivas, en el que un anticuerpo que reconoce un marcador de superficie de elección puede unirse a un reactivo de marcaje y, al agregarlo al medio de cultivo, las células que expresan el marcador específico pueden obtener imágenes fácilmente en tiempo real mediante imágenes de células vivas. La visualización y cuantificación de la expresión de marcadores utilizando un sistema de este tipo puede lograrse fácilmente cuando las células se cultivan en condiciones de cultivo bidimensionales (2D)¹⁰.

En este estudio, optimizamos los protocolos para la invasión inmunocitoquímica de células vivas en 3D y la migración de células derivadas de pacientes con glioma difuso difuso de línea media (DMG) pediátrico^11,12. Los DMG son tumores cerebrales altamente agresivos que afectan a los niños, en su gran mayoría asociados con la mutación conductora K27M en las variantes de la histona H3. Los DMG surgen en el tronco encefálico y en las regiones de la línea media del sistema nervioso central (SNC) y se caracterizan por una naturaleza altamente infiltrativa. Se ha demostrado que esta capacidad invasiva está, al menos en parte, mediada por la heterogeneidad intratumoral y las características similares a las de las células madre cancerosas de las células DMG⁷.

Para ejemplificar nuestros ensayos, se utilizó un reactivo de marcado de anticuerpos (ALR) en combinación con un anticuerpo para CD44. CD44 es una glicoproteína transmembrana y una molécula de adhesión expresada en células madre y otros tipos de células, asociada con el fenotipo de células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales¹³. Los protocolos incluyen la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes en modo de campo claro y fluorescente, y el análisis en un instrumento de análisis de células vivas que permitió medir cuantitativamente en tiempo real la expresión global de CD44 en la membrana celular de DMG durante la invasión y migración 3D. Los ensayos también permitieron visualizar la señal fluorescente intermitente de CD44 en células individuales mientras migran e invaden. Curiosamente, también se observó un efecto del anticuerpo anti-CD44, que potencialmente actuando como un anticuerpo bloqueador, también pareció reducir la migración e invasión celular, así como inducir un cambio en el patrón de invasión de un fenotipo colectivo de tipo mesenquimal a un fenotipo más similar al amebo de una sola célula.

Protocol

Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética en investigación en humanos de las instituciones. NOTA: Este estudio se realizó utilizando el instrumento de análisis de células vivas Incucyte S3 y/o SX5 (referenciado como instrumento de análisis de células vivas). 1. Generación de esferoides tumorales de tamaño reproducible NOTA: Se utilizó el protocolo (sección 1) descrito por Vinci et al. 2015 <su…

Representative Results

El protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D para la invasión y la migración se resume en un flujo de trabajo sencillo y reproducible en la Figura 1. Al sembrar las células DMG en placas de fondo redondo ULA de 96 pocillos, se obtienen NS de tamaño reproducible y se utilizan en los pasos que se muestran. Cuando los SN han alcanzado el tamaño ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 días después de la siembra) se inician los ensayos de invasión12 y mi…

Discussion

La inmunocitoquímica de células vivas en 3D que hemos adoptado aquí para la invasión y migración pediátrica de DMG podría adaptarse fácilmente también a otros tipos de células tumorales altamente invasivas, incluidas las líneas celulares de cáncer de mama y colon.

A diferencia de los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas 2D realizados anteriormente¹⁰, cuando se trabaja en 3D, se sugiere prestar atención a algunos pasos críticos. En particular, p…

Materials

96 Well TC-Treated Microplates	Corning	3595	size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom
Accutase	Euroclone	ECB3056D	solution for neurosphere dissociation
Burker chamber	Mv medical	FFL16034	cell counting chamber
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	Mouse mAb IgG2a
Corning Matrigel Matrix	Corning	356237	Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free
Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye	Incucyte	4743	Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry
Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument	Sartorius	–	The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.
Inverted Microscope		–	any inverted microscope
Opti-Green Background Suppressor Reagent	Incucyte	6500-0045	Backgroung suppressor reagent (BSR)
Tumor stem cell (TSM) medium	–	–	growth cell medium (see reference in the text for details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Corning Costar	7007	size 96 well, round bottom clear