Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms
Summary
In dieser Studie wird ein Protokoll der Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie vorgestellt, das auf eine pädiatrische diffuse Mittellinien-Gliomzelllinie angewendet wird, um die Expression von Proteinen auf der Plasmamembran während dynamischer Prozesse wie 3D-Zellinvasion und -migration in Echtzeit zu untersuchen.
Abstract
Zellmigration und Zellinvasion sind spezifische Kennzeichen von H3K27M-mutierten Tumoren des diffusen Mittellinienglioms (DMG). Wir haben diese Merkmale bereits mit dreidimensionalen (3D) zellbasierten Invasions- und Migrationsassays modelliert. In dieser Studie haben wir diese 3D-Assays für die Immunzytochemie lebender Zellen optimiert. Ein Antikörper-Markierungsreagenz wurde verwendet, um die Expression des Adhäsionsmoleküls CD44 auf der Plasmamembran von migrierenden und eindringenden Zellen einer DMG H3K27M primären Patientenzelllinie in Echtzeit zu detektieren. CD44 ist mit dem Phänotyp von Krebsstammzellen und der Migration und Invasion von Tumorzellen assoziiert und an den direkten Interaktionen mit der extrazellulären Matrix des Zentralnervensystems (ZNS) beteiligt. Neurosphären (NS) aus der DMG H3K27M-Zelllinie wurden in die Basalmembranmatrix (BMM) eingebettet oder in Gegenwart eines Anti-CD44-Antikörpers in Verbindung mit dem Antikörpermarkierungsreagenz (ALR) auf eine dünne Beschichtungsschicht aus BMM aufgebracht. Die immunzytochemische Live-3D-Zellanalyse wurde auf einem Lebendzellanalysegerät durchgeführt, um die gesamte CD44-Expression, insbesondere auf den migrierenden und eindringenden Zellen, quantitativ zu messen. Die Methode ermöglicht es auch, die intermittierende Expression von CD44 auf der Plasmamembran von migrierenden und eindringenden Zellen in Echtzeit zu visualisieren. Darüber hinaus lieferte der Assay auch neue Einblicke in die mögliche Rolle von CD44 beim Übergang von mesenchymal zu amöboid in DMG H3K27M-Zellen.
Introduction
Die Fähigkeit von Tumorzellen, sich dem umgebenden Gewebe zu entziehen und es zu verbreiten, ist ein Kennzeichen von Krebs1. Insbesondere die Tumorzellmotilität ist ein charakteristisches Merkmal maligner Tumoren, unabhängig davon, ob es sich um einen metastasierten Tumortyp wie Brust2 oder Darmkrebs3 oder einen lokal invasiven Typ wie das diffuse Gliomhandelt 4,5.
Die Bildgebung spielt eine zentrale Rolle bei der Untersuchung vieler Aspekte von Tumorzellphänotypen; Bei der Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse wie Migration und Invasion ist jedoch die Bildgebung lebender Zellen definitiv zu bevorzugen, wenn Veränderungen in der Morphologie und der Zell-Zell-Interaktion auftreten 6,7 und im Laufe der Zeit leichter untersucht werden können. Für die Bildgebung lebender Zellen können verschiedene optische Mikroskopiesysteme verwendet werden, vom Phasenkontrastmikroskop bis zum konfokalen Fluoreszenzmikroskop, und die Bildaufnahme über einen kurzen oder langen Zeitraum auf einem inversen Mikroskop, das mit einer Kammer zur Temperatur- und CO2 -Kontrolle ausgestattet ist, oder in High-Content-Bildanalysesystemen mit eingebauten Kammern oder alternativ in Bildsystemen, die im Inkubator sitzen können, ohne dass die Zellen während der gesamten Dauer gestört werden müssen des Experiments. Die Wahl des verwendeten Systems wird häufig von einer Reihe von Faktoren bestimmt, wie z. B. der erforderlichen Auflösung, der Länge der Gesamterfassungszeit und der Zeitintervalle, dem verwendeten Gefäßtyp und dem Durchsatz des Assays (Einkammer- oder Multi-Well-Platte), der Empfindlichkeit der verwendeten Zellen (Edel- und/oder seltene Zellen) und der Phototoxizität der Zellen, wenn Fluorophore vorhanden sind.
Im Hinblick auf die Fluoreszenzbildgebung im Live-Modus kann dies erreicht werden, indem Zellen für die Expression fluoreszierender Proteine entweder für eine stabile Expression oder als induzierbares System8 transduzierbar gemacht werden, durch transiente Zelltransfektion oder durch die Verwendung von Zellfarbstoffen, die jetzt für die Markierung lebender Zellen7, für die Verfolgung lebender Zellen sowie für die Markierung subzellulärer Organellen9 zur Verfügung stehen.
Kürzlich wurde ein nützlicher Ansatz für die Immunzytochemie lebender Zellen entwickelt, bei dem ein Antikörper, der einen Oberflächenmarker der Wahl erkennt, an ein Markierungsreagenz gebunden werden kann, und nach Zugabe zu den Kulturmedien können Zellen, die den spezifischen Marker exprimieren, leicht in Echtzeit durch Lebendzell-Bildgebung abgebildet werden. Die Visualisierung und Quantifizierung der Markerexpression unter Verwendung eines solchen Systems kann leicht erreicht werden, wenn Zellen unter zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet werden10.
In dieser Studie haben wir Protokolle für die Invasion und Migration von pädiatrischen diffusen Mittelliniengliomen (DMG)-Patientenzellen optimiert11,12. DMG sind hochaggressive Hirntumoren, die Kinder betreffen und in der überwiegenden Mehrheit mit der Treibermutation K27M in Histon-H3-Varianten assoziiert sind. DMG entstehen im Hirnstamm und in den Mittellinienregionen des Zentralnervensystems (ZNS) und zeichnen sich durch eine stark infiltrative Natur aus. Es wurde gezeigt, dass diese invasive Fähigkeit zumindest teilweise durch die intratumorale Heterogenität und die krebsstammähnlichen Merkmale von DMG-Zellen vermittelt wird7.
Zur Veranschaulichung unserer Assays wurde ein Antikörpermarkierungsreagenz (ALR) in Kombination mit einem Antikörper gegen CD44 verwendet. CD44 ist ein Transmembran-Glykoprotein und Adhäsionsmolekül, das auf Stammzellen und anderen Zelltypen exprimiert wird und mit dem Phänotyp von Krebsstammzellen und der Migration und Invasion von Tumorzellen assoziiertist 13. Die Protokolle umfassen die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme im Hellfeld- und Fluoreszenzmodus und die Analyse auf einem Lebendzellanalysegerät, das es ermöglichte, die gesamte CD44-Expression auf der DMG-Zellmembran während der 3D-Invasion und -Migration quantitativ in Echtzeit zu messen. Die Assays ermöglichten auch die Möglichkeit, das intermittierende Fluoreszenzsignal von CD44 auf einzelnen Zellen während der Migration und Invasion sichtbar zu machen. Interessanterweise wurde auch ein Effekt des Anti-CD44-Antikörpers beobachtet, der möglicherweise als blockierender Antikörper fungiert und auch die Zellmigration und -invasion zu reduzieren schien und einen Wechsel des Invasionsmusters von einem kollektiven mesenchymalartigen zu einem eher einzelligen amöbenartigen Phänotyp zu induzieren schien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie, die wir hier für die pädiatrische DMG-Invasion und -Migration übernommen haben, könnte auch für andere hochinvasive Tumorzelltypen, einschließlich Brust- und Darmkrebszelllinien, leicht angepasst werden.
Anders als bei zuvor durchgeführten Live-2D-Zell-Immunzytochemie-Assays10 wird bei der Arbeit in 3D empfohlen, auf einige kritische Schritte zu achten. Insbesondere für den von uns beschriebenen Invasionsassay wird empfohlen,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Silvia Soddu und Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) für den Zugang zum IncuCyte S3 Live Cell Imaging System bei der vorläufigen Erstellung des Bildgebungsprotokolls. Ausserdem danken wir Bernadett Kolozsvari für die technische Beratung. Die Studie wurde durch das Stipendium von Children with Cancer UK (16-234) und das italienische Gesundheitsministerium Ricerca Corrente unterstützt. M Vinci ist Stipendiatin von Children with Cancer UK. R Ferretti ist Stipendiat der Fondazione Veronesi (2018 und 2019). Die Autoren danken der Fondazione Heal für ihre Unterstützung und der Children’s Hospital Foundation für die Finanzierung der Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
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