이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.
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방법 논문
소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포 이동 및 침습은 미만성 정중선 신경아교종(DMG) H3K27M 돌연변이 종양의 특정 특징입니다. 우리는 이미 3차원(3D) 세포 기반 침입 및 이동 분석을 사용하여 이러한 특징을 모델링했습니다. 이 연구에서 우리는 생세포 면역세포화학을 위해 이러한 3D 분석을 최적화했습니다. 항체 라벨링 시약을 사용하여 DMG H3K27M 일차 환자 유래 세포주의 이동 및 침입 세포의 원형질막에서 접착 분자 CD44의 발현을 실시간으로 검출했습니다. CD44는 암 줄기 세포 표현형 및 종양 세포 이동 및 침윤과 관련이 있으며 중추신경계(CNS) 세포외 기질과의 직접적인 상호작용에 관여합니다. DMG H3K27M 세포주의 신경구(NS)를 항체 표지 시약(ALR)과 함께 항-CD44 항체의 존재 하에 기저막 매트릭스(BMM)에 매립하거나 BMM의 얇은 코팅층 위에 놓았습니다. 전체 CD44 발현, 특히 이동 및 침입 세포에 대한 정량적 측정을 위해 생세포 분석 장비에서 생-3D 세포 면역세포화학 이미지 분석을 수행하였다. 이 방법은 또한 이동 및 침입 세포의 원형질막에서 CD44의 간헐적 발현을 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 이 분석은 DMG H3K27M 세포의 중간엽에서 아메보이드로의 전이에서 CD44의 잠재적 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.
서론
종양 세포가 주변 조직을 통해 회피하고 전파하는 능력은 암의 특징입니다1. 특히, 종양 세포 운동성은 유방2 또는 결장직장암3과 같은 전이성 종양 유형이든 미만성 신경교종과 같은 국소 침습성 유형이든 악성 종양의 특징입니다 4,5.
이미징은 종양 세포 표현형의 여러 측면을 조사하는 데 중심적인 역할을 합니다. 그러나, 생세포 이미징은 형태 및 세포-세포 상호작용 6,7의 변화가 발생하고 시간이 지남에 따라 더 쉽게 검사될 수 있는 이동 및 침입과 같은 동적 세포 과정을 연구할 때 확실히 선호됩니다. 라이브 셀 이미징의 경우, 위상차에서 컨포칼 형광 현미경에 이르기까지 다양한 광학 현미경 시스템을 사용할 수 있으며, 온도 및CO2 제어를 위한 챔버가 장착된 도립 현미경에서 단기간 또는 장기간에 걸쳐 이미지 획득을 수행하거나, 챔버가 내장된 고함량 이미지 분석 시스템에서, 또는 전체 기간 동안....
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프로토콜
이 프로토콜은 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
참고: 이 연구는 Incucyte S3 및/또는 SX5 Live-Cell Analysis Instrument(라이브 셀 분석 기기로 참조)를 사용하여 수행되었습니다.
1. 재현 가능한 크기의 종양 스페로이드 생성
참고: Vinci et al. 2015 7,12에 의해 설명된 프로토콜(섹션 1)은 일부 수정을 거쳐 아래에 보고된 대로 사용되었습니다.
- DMG H3K27M-돌연변이 신경구(NS)를 수집하고 실온(RT)에서 10분(분) 동안 170 x g 에서 원심분리합니다.
- NS를 500 μL의 아큐타제 용액과 함께 37°C에서 3분 동안 인큐베이션하여 이들을 분해한다.
- 아큐타제 용액을 종양 줄기 세포 (TSM) 배지7 로 중화시키고, 세포 현탁액을 RT에서 5분 동안 355 x g 에서 원심분리한다.
- 세포 ....
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결과
침습 및 이동을 위한 Live-3D-Cell Immunocytochemistry 프로토콜은 그림 1에 간단하고 재현 가능한 워크플로우로 요약되어 있습니다. ULA 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 DMG 세포를 시딩함으로써, 재현 가능한 크기의 NS를 얻어지고, 표시된 단계에서 사용된다. NS가 ~300 μm(파종 후 약 4일)의 이상적인 크기에 도달하면 침습12 및 이동14 분석이 시작됩니다. 개별 NS의 배지에 배경 억제 인자와 함께 ALR / 항체 복합체를 추가하면 세포막, 라이브 이미징 및 시간 경과에 따른 특정 마커 발현을 추적 할 수 있습니다. 세포 침윤 및 이동 중 표면 마커 발현은 생세포 분석 기기를 사용하여 t = 0에서 최대 96시간 간격으로 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 이 이미징 시스템을 사용하면 완전 자동화된 이미지 분석이 가능합니다.
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토론
소아 DMG 침습 및 이동을 위해 여기에서 채택한 생3D 세포 면역세포화학은 유방암 및 결장암 세포주를 포함한 다른 고침습성 종양 세포 유형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.
이전에 수행된 생-2D-세포 면역세포화학 분석법(live-2D-cell immunocytochemistry assay)10과 달리, 3D로 작업할 때, 몇 가지 중요한 단계에 주의를 기울이는 것이 좋다. 특히, 우리가 설명하는 침습 분석의 경우, BMM을 첨가하기 전에 각 웰에서 NS와 함께 ALR/항체 혼합물을 배지에 직접 첨가하는 것이 좋으며, BMM이나 일단 겔화된 BMM의 상부에는 첨가하지 않는 것이 좋습니다. 이는 시약과 배지의 좋은 혼합을 허용하고 시약이 세포 표면에 보다 직접적으로 접근할 수 있도록 하기 위한 것입니다. 또한 더 나은 이미징 품질을 보장하기 위해 프로토콜에 BSR 사용이 포함되어 있지만 페놀 레드가 없는 배지와 BMM을 사용하는 것이 좋습.......
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공개 사항
저자는 원고에서 논의된 주제 또는 자료에 재정적 이해관계가 있거나 재정적 갈등이 있는 조직 또는 단체와 관련 제휴 또는 재정적 관여가 없습니다.
감사의 글
이미징 프로토콜의 예비 설정에서 IncuCyte S3 라이브 셀 이미징 시스템에 액세스해 주신 Silvia Soddu 박사와 Giulia Federici 박사(IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, 이탈리아 로마의 세포 네트워크 및 분자 치료 표적 단위)에게 감사드립니다. 또한 기술적인 조언을 해주신 Bernadett Kolozsvari에게 감사드립니다. 이 연구는 Children with Cancer UK 보조금 (16-234)과 이탈리아 보건부 Ricerca Corrente의 지원을 받았습니다. M Vinci는 Children with Cancer UK Fellow입니다. R Ferretti는 Fondazione Veronesi Fellowship (2018 및 2019)의 수혜자입니다. 저자는 Fondazione Heal의 지원과 Queensland Children's Tumor Bank에 자금을 지원한 Children's Hospital Foundation에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 TC 처리 마이크로플레이트 | Corning | 3595 | 크기 96웰, 폴리스티렌 플레이트, 평평한 바닥 |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D 신경구 해리용 솔루션 | |
| Burker 챔버 Mv | 의료용 | FFL16034 | 계수 챔버 |
| CD-44 (156-3C11) | 세포 신호 전달 기술 | 3570 | 마우스 mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 항체 라벨링 염료 | Incucyte | 4743 | 항체 라벨링 시약(ALR): 생세포 면역세포화학을 위한 마우스 IgG2a 488 항체 |
| Incucyte S3 및/또는 SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | Incucyte S3 및/또는 SX5 기기는 실시간 세포 모니터링 및 감시, 세포 건강 및 생존력, 이동 및 침입, 광범위한 표현형 세포 기반 분석에 사용됩니다. |
| 도립 현미경 | - | 모든 도립 현미경 | |
| Opti-Green 배경 억제기 시약 | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung 억제 시약 (BSR) |
| 종양 줄기 세포 (TSM) 매체 | - | 성장 세포 매체 (자세한 내용은 텍스트의 참조 참조) | |
| 초저 부착 다중 웰 플레이트 | Corning Costar | 7007 | 크기 96 웰, 둥근 바닥 맑다 |
참고문헌
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A.
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재인쇄 및 허가
