Live-3D-cell immunocytokemi analyser av pediatriskt diffust mittlinjegliom
Summary
Denna studie presenterar ett protokoll för levande 3D-cellimmunocytokemi applicerat på en pediatrisk diffus gliomcellinje, användbar för att studera i realtid uttrycket av proteiner på plasmamembranet under dynamiska processer som 3D-cellinvasion och migration.
Abstract
Cellmigration och invasion är specifika kännetecken för diffusa mittlinjegliom (DMG) H3K27M-mutanta tumörer. Vi har redan modellerat dessa funktioner med hjälp av tredimensionella (3D) cellbaserade invasions- och migrationsanalyser. I denna studie har vi optimerat dessa 3D-analyser för levande cellimmunocytokemi. Ett antikroppsmärkningsreagens användes för att i realtid detektera uttrycket av vidhäftningsmolekylen CD44, på plasmamembranet hos migrerande och invaderande celler i en DMG H3K27M primär patient-härledd cellinje. CD44 är associerat med cancerstamcellsfenotyp och tumörcellsmigration och invasion och är involverat i de direkta interaktionerna med den extracellulära matrisen i centrala nervsystemet (CNS). Neurosfärer (NS) från DMG H3K27M-cellinjen inbäddades i basalmembranmatrisen (BMM) eller placerades på ett tunt beläggningsskikt av BMM, i närvaro av en anti-CD44-antikropp i kombination med antikroppsmärkningsreagenset (ALR). Den levande 3D-cellimmunocytokemiska bildanalysen utfördes på ett levande cellanalysinstrument för att kvantitativt mäta det övergripande CD44-uttrycket, särskilt på de migrerande och invaderande cellerna. Metoden gör det också möjligt att i realtid visualisera det intermittenta uttrycket av CD44 på plasmamembranet hos migrerande och invaderande celler. Dessutom gav analysen också nya insikter om CD44: s potentiella roll i mesenkymal till amoeboidövergång i DMG H3K27M-celler.
Introduction
Tumörcellernas förmåga att undvika och sprida sig genom den omgivande vävnaden är ett kännetecken för cancer1. I synnerhet är tumörcellmotilitet ett karakteristiskt drag hos maligna tumörer, oavsett om det är en metastatisk tumörtyp såsom bröst2 eller kolorektal cancer3 eller en lokalt invasiv typ såsom diffust gliom 4,5.
Avbildning har en central roll i undersökningen av många aspekter av tumörcellfenotyper; Levande cellavbildning är dock definitivt att föredra när man studerar dynamiska cellulära processer som migration och invasion, när förändringar i morfologi och cell-cellinteraktion 6,7 inträffar och lättare kan undersökas över tiden. För levande cellavbildning kan olika optiska mikroskopisystem användas, från faskontrast till konfokala fluorescerande mikroskop, och bildinsamling utförs under en kort eller lång tidsperiod på ett inverterat mikroskop utrustat med en kammare för temperatur och CO2-kontroll, eller i höginnehållsbildanalyssystem som har inbyggda kammare, eller alternativt i bildsystem som kan sitta i inkubatorn utan att behöva störa cellerna under hela tiden av experimentet. Valet av vilket system som används bestäms ofta av ett antal faktorer såsom den upplösning som behövs, längden på den totala förvärvstiden och tidsintervallen, fartygstyp som används och analysens genomströmning (enkammare eller flerbrunnsplatta), känsligheten hos de celler som används (värdefulla och/eller sällsynta celler) och cellernas fototoxicitet om fluoroforer förekommer.
När det gäller fluorescerande avbildning i live-läge kan detta uppnås genom att transducera celler för uttryck av fluorescerande proteiner antingen för stabilt uttryck eller som ett inducerbart system8, genom övergående celltransfektion eller genom att använda cellfärgämnen som nu är tillgängliga för märkning av levande celler7, för spårning av levande celler samt för märkning av subcellulära organeller9.
Ett användbart tillvägagångssätt har nyligen utvecklats för levande cellimmunocytokemi, där en antikropp som känner igen en valfri ytmarkör kan bindas till ett märkningsreagens, och vid tillägg till odlingsmediet kan celler som uttrycker den specifika markören lätt avbildas i realtid genom levande cellavbildning. Visualisering och kvantifiering av marköruttryck med hjälp av ett sådant system kan enkelt uppnås när celler odlas i tvådimensionella (2D) odlingsförhållanden10.
I denna studie optimerade vi protokoll för invasion av levande 3D-cellsimmunocytokemi och migration av pediatriska diffusa midlinegliom (DMG) patienthärledda celler11,12. DMG är mycket aggressiva hjärntumörer som drabbar barn, för de allra flesta associerade med drivarmutationen K27M i histon H3-varianter. DMG uppstår i hjärnstammen och mittlinjeregionerna i centrala nervsystemet (CNS) och kännetecknas av en mycket infiltrativ natur. Denna invasiva kapacitet har visat sig åtminstone delvis medieras av intratumor heterogenitet och cancerstamliknande egenskaper hos DMG-celler7.
För att exemplifiera våra analyser användes ett antikroppsmärkningsreagens (ALR) i kombination med en antikropp för CD44. CD44 är en transmembranglykoprotein och adhesionsmolekyl uttryckt på stamceller och andra celltyper, associerad med cancerstamcellsfenotyp och tumörcellmigration och invasion13. Protokollen inkluderar provberedning, bildförvärv i ljusfält och fluorescerande läge och analysen på ett levande cellanalysinstrument som gjorde det möjligt att kvantitativt mäta i realtid det övergripande CD44-uttrycket på DMG-cellmembranet under 3D-invasion och migration. Analyserna möjliggjorde också möjligheten att visualisera den intermittenta fluorescerande signalen från CD44 på enskilda celler under migrering och invasion. Intressant nog observerades också en effekt av anti-CD44-antikroppen, som potentiellt fungerade som en blockerande antikropp, tycktes också minska cellmigration och invasion samt inducera en förändring av invasionsmönstret från en kollektiv mesenkymalliknande till en mer encellig amoeboidliknande fenotyp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den levande 3D-cellimmunocytokemin som vi har antagit här för pediatrisk DMG-invasion och migration kan enkelt anpassas även för andra mycket invasiva tumörcelltyper, inklusive bröst- och tjocktarmscancercellinjer.
Till skillnad från tidigare utförda live-2D-cell immunocytokemianalyser10, när man arbetar i 3D, föreslås att man uppmärksammar några kritiska steg. I synnerhet, för invasionsanalysen som vi beskriver, rekommenderas det att tillsätta ALR / ant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr. Silvia Soddu och Dr. Giulia Federici (Enheten för cellulära nätverk och molekylära terapeutiska mål, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) för tillgång till IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i den preliminära uppsättningen av bildprotokollet. Dessutom tackar vi Bernadett Kolozsvari för den tekniska rådgivningen. Studien stöddes av Children with Cancer UK-bidraget (16-234) och det italienska hälsoministeriet Ricerca Corrente. M Vinci är en Barn med Cancer UK Fellow. R Ferretti är mottagare av Fondazione Veronesi Fellowship (2018 och 2019). Författarna erkänner Fondazione Heal för deras stöd och Children’s Hospital Foundation för finansiering av Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
