Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica
Summary
Questo studio presenta un protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive applicato ad una linea cellulare di glioma diffuso pediatrico della linea mediana, utile per studiare in tempo reale l’espressione delle proteine sulla membrana plasmatica durante processi dinamici come l’invasione e la migrazione delle cellule 3D.
Abstract
La migrazione e l’invasione cellulare sono caratteristiche specifiche dei tumori mutanti H3K27M del glioma diffuso della linea mediana (DMG). Abbiamo già modellato queste caratteristiche utilizzando saggi di invasione e migrazione tridimensionali (3D) basati su cellule. In questo studio, abbiamo ottimizzato questi saggi 3D per l’immunocitochimica delle cellule vive. Un antibody labeling reagent è stato utilizzato per rilevare in tempo reale l’espressione della molecola di adesione CD44, sulla membrana plasmatica delle cellule migranti e invasive di una linea cellulare primaria DMG H3K27M derivata dal paziente. CD44 è associato al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali ed è coinvolto nelle interazioni dirette con la matrice extracellulare del sistema nervoso centrale (SNC). Le neurosfere (NS) della linea cellulare DMG H3K27M sono state incorporate nella matrice della membrana basale (BMM) o posizionate su un sottile strato di rivestimento di BMM, in presenza di un anticorpo anti-CD44 in combinazione con il reagente di etichettatura degli anticorpi (ALR). L’analisi dell’immagine immunocitochimica delle cellule 3D vive è stata eseguita su uno strumento di analisi delle cellule vive per misurare quantitativamente l’espressione complessiva di CD44, in particolare sulle cellule migratorie e invasori. Il metodo consente inoltre di visualizzare in tempo reale l’espressione intermittente di CD44 sulla membrana plasmatica delle cellule migratorie e invasori. Inoltre, il test ha anche fornito nuove informazioni sul potenziale ruolo di CD44 nella transizione da mesenchimale ad ameboide nelle cellule DMG H3K27M.
Introduction
La capacità delle cellule tumorali di eludere e diffondersi attraverso il tessuto circostante è un segno distintivo del cancro1. In particolare, la motilità delle cellule tumorali è una caratteristica dei tumori maligni, sia che si tratti di un tipo di tumore metastatico come il cancro della mammella2 o del colon-retto3 o di un tipo localmente invasivo come il glioma diffuso 4,5.
L’imaging ha un ruolo centrale nello studio di molti aspetti dei fenotipi delle cellule tumorali; Tuttavia, l’imaging delle cellule vive è sicuramente da preferire quando si studiano processi cellulari dinamici come la migrazione e l’invasione, quando si verificano cambiamenti nella morfologia e nell’interazione cellula-cellula 6,7 e possono essere esaminati più facilmente nel tempo. Per l’imaging di cellule vive possono essere utilizzati diversi sistemi di microscopia ottica, dal contrasto di fase ai microscopi fluorescenti confocali, e l’acquisizione di immagini eseguita per un breve o lungo periodo di tempo su un microscopio invertito dotato di una camera per il controllo della temperatura e della CO2, o in sistemi di analisi delle immagini ad alto contenuto che hanno camere incorporate, o in alternativa in sistemi di immagini che possono stare nell’incubatore senza la necessità di disturbare le cellule durante l’intera durata dell’esperimento. La scelta del sistema utilizzato è spesso dettata da una serie di fattori quali la risoluzione necessaria, la durata del tempo e degli intervalli di tempo complessivi di acquisizione, il tipo di vaso utilizzato e la produttività del saggio (monocamera o piastra multipozzetto), la sensibilità delle cellule utilizzate (cellule preziose e/o rare) e la fototossicità delle cellule se sono presenti fluorofori.
Per quanto riguarda l’imaging fluorescente in modalità live, ciò può essere ottenuto trasducendo le cellule per l’espressione di proteine fluorescenti sia per l’espressione stabile che come sistema inducibile8, mediante trasfezione di cellule transitorie, o utilizzando coloranti cellulari che sono ora disponibili per l’etichettatura di cellule vive7, per il tracciamento di cellule vive e per l’etichettatura di organelli subcellulari9.
Un approccio utile è stato recentemente sviluppato per l’immunocitochimica delle cellule vive, in cui un anticorpo che riconosce un marcatore di superficie di scelta può essere legato a un reagente di marcatura e, dopo l’aggiunta ai terreni di coltura, le cellule che esprimono il marcatore specifico possono essere prontamente visualizzate in tempo reale mediante imaging di cellule vive. La visualizzazione e la quantificazione dell’espressione dei marcatori utilizzando un tale sistema possono essere facilmente ottenute quando le cellule sono coltivate in condizioni di coltura bidimensionale (2D)10.
In questo studio, abbiamo ottimizzato i protocolli per l’invasione immunocitochimica delle cellule immunocitochimiche 3D vive e la migrazione delle cellule derivate dai pazienti con glioma diffuso della linea mediana pediatrica (DMG)11,12. I DMG sono tumori cerebrali altamente aggressivi che colpiscono i bambini, per la stragrande maggioranza associati alla mutazione driver K27M nelle varianti H3 dell’istone. I DMG insorgono nel tronco encefalico e nelle regioni mediane del sistema nervoso centrale (SNC) e sono caratterizzati da una natura altamente infiltrativa. Questa capacità invasiva ha dimostrato di essere almeno in parte mediata dall’eterogeneità intratumorale e dalle caratteristiche simili a staminali tumorali delle cellule DMG7.
Per esemplificare i nostri test, è stato utilizzato un reagente di etichettatura anticorpale (ALR) in combinazione con un anticorpo per CD44. CD44 è una glicoproteina transmembrana e una molecola di adesione espressa sulle cellule staminali e su altri tipi di cellule, associata al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali13. I protocolli includono la preparazione del campione, l’acquisizione di immagini in modalità brightfield e fluorescente e l’analisi su uno strumento di analisi di cellule vive che ha permesso di misurare quantitativamente in tempo reale l’espressione complessiva di CD44 sulla membrana cellulare DMG durante l’invasione e la migrazione 3D. I saggi hanno anche permesso di visualizzare il segnale fluorescente intermittente di CD44 su singole cellule durante la migrazione e l’invasione. È interessante notare che è stato osservato anche un effetto dell’anticorpo anti-CD44, che potenzialmente agendo come anticorpo bloccante, sembrava anche ridurre la migrazione e l’invasione cellulare, nonché indurre un passaggio del modello di invasione da un fenotipo mesenchimale collettivo a un fenotipo più simile all’ameboide a singola cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’immunocitochimica delle cellule 3D vive che abbiamo adottato qui per l’invasione e la migrazione del DMG pediatrico potrebbe essere facilmente adattata anche per altri tipi di cellule tumorali altamente invasive, comprese le linee cellulari di cancro al seno e al colon.
A differenza dei saggi di immunocitochimica delle cellule 2D vive precedentemente eseguiti10, quando si lavora in 3D, si suggerisce di prestare attenzione ad alcuni passaggi critici. In particolare, p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano la Dott.ssa Silvia Soddu e la Dott.ssa Giulia Federici (Unità di Reti Cellulari e Bersagli Terapeutici Molecolari, IRCCS-Istituto Nazionale Tumori Regina Elena, Roma, Italia) per l’accesso al sistema di imaging IncuCyte S3 Live Cell nell’impostazione preliminare del protocollo di imaging. Inoltre, ringraziamo Bernadett Kolozsvari per la consulenza tecnica. Lo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione Children with Cancer UK (16-234) e dal Ministero della Salute italiano Ricerca Corrente. M Vinci è un Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti è vincitore della Fondazione Veronesi Fellowship (2018 e 2019). Gli autori riconoscono Fondazione Heal per il loro sostegno e la Children’s Hospital Foundation per il finanziamento della Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
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