Shotgun 蛋白质组学 样品处理 由开源实验室机器人自动执行
Summary
提供了详细的协议和三个Python脚本，用于操作开源机器人液体处理系统，以执行质谱实验的半自动蛋白质样品制备，包括去垢剂去除，蛋白质消化和肽脱盐步骤。
Abstract
基于质谱的鸟枪蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括酶蛋白消化和纯化，这可能占用大量的工作台劳动，并存在批次间变异性的来源。使用移液机器人实现实验室自动化可以减少手动工作，最大限度地提高通量，并提高研究的可重复性。尽管如此，标准自动化站的起始价格高昂，使许多学术实验室无法负担得起。本文介绍了使用经济实惠的开源自动化系统（Opentrons OT-2）的蛋白质组学样品制备工作流程，包括设置半自动蛋白质还原，烷基化，消化和纯化步骤的说明;以及随附的开源Python脚本，通过其应用程序编程接口对OT-2系统进行编程。
Introduction
基于质谱的鸟枪蛋白质组学是同时测量生物样品中许多蛋白质丰度的有力工具。具有生物信息学分析的蛋白质组学实验通常用于识别生物标志物并发现支持病理机制的相关生物复合物和途径。凭借其高分析物特异性和潜在的定量准确性，鸟枪蛋白质组学还具有极好的潜力，可以被研究机构和诊断实验室用于临床样品分析，而无需依赖抗体1，2。
为了制备用于鸟枪蛋白质组学分析的蛋白质样品，从生物样品（例如，细胞和组织）中提取的蛋白质通常首先需要使用冗长的方案进行处理，包括测量样品蛋白质浓度，蛋白质还原和烷基化，以及酶消化成肽。此外，在含有去垢剂的普通裂解缓冲液中提取的蛋白质在分析之前通常需要额外的缓冲液交换或去除洗涤剂的步骤，因为洗涤剂会干扰胰蛋白酶消化并显着降低下游液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析的性能3。肽通常在酶消化后在LC-MS / MS相容性溶剂中进一步脱盐，干燥和重组。这些蛋白质生化程序可能是劳动密集型和耗时的。因此，它们继续限制蛋白质组学工作流程的通量，并导致所获取数据的可变性4，5。人为错误和偏差已被公认为影响数据方差和可重复性的关键因素6，7。为了最大限度地减少质谱样品制备工作流程中的人为错误，已利用自动移液机器人系统来提高鸟枪蛋白质组学和靶向质谱分析中蛋白质鉴定和定量的通量和再现性，其中这些进步被誉为有助于继续推动蛋白质组学技术在关键研究和临床环境中的广泛采用8，9，10，11，12，13。然而，大多数现有的协议都使用机器人液体处理平台，这些平台需要大量的投资和培训，限制了它们在学术环境中的许多实验室中的实用性，或者预算有限。
本文介绍了一种方案，该协议利用低成本、开源的机器人液体处理系统OT-2，对典型的鸟枪蛋白质组学样品制备工作流程进行半自动化。OT-2的成本低于许多其他机器人液体处理系统，在撰写本文时，成本约为5，000美元。当考虑到不同模块和实验室器皿的价格时，在撰写本文时，在该协议中设置实验的总成本约为10，000美元，这使得它对于更广泛的实验室来说比更昂贵的选择更实惠。OT-2通过Python脚本与开源编程兼容，并在用户定义的DIY协议设计中提供了极大的灵活性。使用三个内部开发的脚本，下面的方案涵盖了在OT-2站上执行典型的鸟枪蛋白质组学样品制备工作流程，具有典型的蛋白质标准品（牛血清白蛋白;BSA）和正常人心裂解物的复杂蛋白质样品（图1）。处理（1）BSA样本和（2）复杂心脏裂解物样本的程序分别在方案第1，2，5，6和3，4，5，6节中详细说明。Sera-Mag羧酸盐修饰的磁珠用于单罐固相增强样品制备（SP3），以去除蛋白质和肽样品中的去垢剂和盐。来自牛血清白蛋白和人心脏蛋白的胰蛋白酶消化物通过SP3微球进一步清洁并提交LC-MS / MS分析。然后使用MaxQuant软件分析质谱，以进行肽和蛋白质鉴定。我们执行的代表性结果表明，该协议实现了出色的技术变异系数（CV），同时节省了工作时间，并且不劣于手工消化。
Protocol
Representative Results
Discussion
协议中的关键步骤
为了获得最佳性能，应使用与OT-2兼容的Opentrons验证的实验室器具，模块和耗材。可以按照 Opentrons 在 Reference14 中的说明创建自定义实验室器具。确保在首次使用时校准OT-2甲板，移液器和实验室器具。遵循SP3磁珠制造商的指南来制备用于肽和蛋白质纯化的微球也至关重要。值得注意的是，在磁珠和肽结合反应过程中，结合反应中乙腈的体积需要?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH授予YH的F32-HL149191奖的部分支持;R00-HL144829 至 EL;R21-HL150456， R00-HL127302， R01-HL141278 至 MPL. 图 1、 图 2、 图 3 是在基于 Web 的科学插图工具（BioRender.com）的帮助下创建的。
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
