Shotgun Proteomics prøvebehandling automatiseret af en open source lab robot
Summary
Detaljeret protokol og tre Python scripts er fastsat for drift af en open source robot væske håndtering system til at udføre semi-automatiseret protein prøve forberedelse til massespektrometri eksperimenter, der dækker fjernelse af vaskemiddel, protein fordøjelse, og peptid afsaltning trin.
Abstract
Massespektrometri-baserede shotgun proteomics eksperimenter kræver flere prøve forberedelse trin, herunder enzymatisk protein fordøjelse og oprydning, som kan tage op betydelige person-timer af bænk arbejdskraft og præsentere en kilde til batch-til-batch variabilitet. Lab automatisering med pipetter robotter kan reducere manuelt arbejde, maksimere gennemløbet, og øge forskning reproducerbarhed. Alligevel gør de stejle startpriser på standardautomatiseringsstationer dem uoverkommelige for mange akademiske laboratorier. I denne artikel beskrives en arbejdsproces for forberedelse af proteomics prøver ved hjælp af et prisbilligt automatiseringssystem (The Opentrons OT-2), herunder instruktioner til opsætning af halvautomatisk proteinreduktion, alkylering, fordøjelse og oprydningstrin. samt ledsagende open source Python scripts til at programmere OT-2-systemet gennem sin ansøgning programmering interface.
Introduction
Massespektrometri-baserede shotgun proteomics er et kraftfuldt værktøj til at måle overflod af mange proteiner i biologiske prøver samtidigt. Proteomics eksperimenter med bioinformatik analyse er rutinemæssigt ansat til at identificere biomarkører og opdage tilknyttede biologiske komplekser og veje, der understøtter patologiske mekanismer. Med sin høje analysand specificitet og potentielle kvantitative nøjagtighed, shotgun proteomics har også fremragende potentiale til at blive vedtaget af forskningsfaciliteter og diagnostiske laboratorier til klinisk prøve analyse uden behov for at stole på antistoffer1,2.
For at forberede proteinprøver til shotgun proteomics analyse, proteiner udvundet fra biologiske prøver (f.eks celler og væv) typisk først skal behandles ved hjælp af lange protokoller, herunder måling af prøven proteinkoncentration, protein reduktion, og alkylation, og enzymatisk fordøjelse i peptider. Desuden kræver proteiner, der udvindes i almindelige lysisbuffere, der indeholder rengøringsmidler, ofte yderligere trin til bufferudveksling eller fjernelse af vaskemiddel før analyse, fordi vaskemiddel kan forstyrre trypsin fordøjelsen og forringe ydeevnen af downstream flydende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse3. Peptider er typisk yderligere afsaltet, tørret og rekonstitueret i LC-MS/MS kompatible opløsningsmidler efter enzymatisk fordøjelse. Disse protein biokemi procedurer kan være arbejdskrævende og tidskrævende. De begrænser således fortsat proteomics arbejdsganges gennemløb og bidrager til variationen af erhvervede data4,5. Menneskelige fejl og fordomme er blevet anerkendt som afgørende faktorer, der påvirker dataafvigelse og reproducerbarhed6,7. For at minimere menneskelige fejl i arbejdsgange for massespektrometriprøvepræparater er automatiserede pipetteringrobotsystemer blevet anvendt til at forbedre gennemløbet og reproducerbarheden af proteinidentifikation og kvantificering fra shotgun proteomics og målrettet massespektrometrianalyse, hvor sådanne fremskridt er blevet hyldet som medvirkende til at fortsætte presset for udbredt indførelse af proteomicsteknologier i kritisk forskning og kliniske indstillinger8 9,10,11,12,13. Men de fleste eksisterende protokoller udnytter robot flydende håndtering platforme, der kræver betydelige investeringer og uddannelse, begrænse deres nytte i mange laboratorier i det akademiske miljø eller på anden måde med et begrænset budget.
I denne artikel beskrives en protokol, der bruger et billigt, open source robotvæskehåndteringssystem, OT-2, til at semiautomatere en typisk arbejdsgang for præparat af proteomics-prøver. OT-2 har en lavere pris end mange andre robot flydende håndteringssystemer, og i skrivende stund koster omkring $ 5.000 dollar. Når factoring i priserne på forskellige moduler og labware, de samlede omkostninger til at oprette eksperimenter i denne protokol i skrivende stund er omkring $ 10.000, hvilket gør det mere overkommeligt at et betydeligt bredere sæt af laboratorier over dyrere muligheder. OT-2 er kompatibel med open source programmering gennem Python scripts og tilbyder stor fleksibilitet i brugerdefinerede DIY protokol design. Ved hjælp af tre in-house udviklede scripts dækker protokollerne nedenfor, der udfører en typisk shotgun proteomics prøveforberedelsesarbejdsgang på OT-2-stationen med en arketypisk proteinstandard (kvægserumalbumin; BSA) og en kompleks proteinprøve af et normalt humant hjertelysat (figur 1). Procedurerne for behandling (1) en BSA-prøve og (2) en kompleks hjertelyatprøve er beskrevet i protokolafsnit 1, 2, 5, 6 og 3, 4, 5, 6. Sera-Mag carboxylate-modificerede magnetiske perler anvendes i enkelt-pot solid-fase-forbedret prøve forberedelse (SP3) for at fjerne rengøringsmidler og salte i protein og peptid prøver. Tryptiske fordøjer fra kvæg serum albumin og menneskelige hjerte proteiner er yderligere renset af SP3 perler og forelagt til LC-MS / MS analyse. Massespektre analyseres derefter ved hjælp af MaxQuant-softwaren til peptid og proteinidentifikation. Repræsentative resultater udført af os viser, at protokollen opnår fremragende tekniske koefficienter for variation (CV), samtidig med at bænktid sparer tid og er ikke-ringere end håndfordøje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
For at opnå den bedste ydeevne bør Der anvendes Opentrons-verificerede labware, moduler og forbrugsvarer, der er kompatible med OT-2. Custom labware kan oprettes efter Opentrons ‘instruktion på Reference14. Sørg for at kalibrere OT-2 dæk, pipetter og labware, når de anvendes for første gang. Det er også vigtigt at følge retningslinjerne fra SP3 perler producent til at forberede perler til peptid og protein oprydning. Navnlig under perle- og …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH awards F32-HL149191 til YH; R00-HL144829 til EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 til MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 oprettes ved hjælp af et webbaseret videnskabeligt illustrationsværktøj, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
