רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח
Summary
פרוטוקול מפורט ושלושה סקריפטים של פייתון מסופקים להפעלת מערכת טיפול בנוזל רובוטי בקוד פתוח לביצוע הכנת דגימת חלבון אוטומטית למחצה לניסויי ספקטרומטריית מסה, המכסים הסרת חומרי ניקוי, עיכול חלבונים ושלבי התפלת פפטידים.
Abstract
ניסויי פרוטאומיקה של רובה ציד מבוססי ספקטרומטריה המונית דורשים מספר שלבי הכנה מדגם, כולל עיכול חלבון אנזימטי וניקוי, אשר יכול לקחת שעות אדם משמעותיות של עבודת ספסל ולהציג מקור של שונות אצווה לאצווה. אוטומציה של מעבדה עם רובוטים מקטרים יכולה להפחית את העבודה הידנית, למקסם את התפוקה ולהגדיל את יכולת הרבייה המחקרית. עם זאת, המחירים ההתחלתיים התלולים של תחנות אוטומציה סטנדרטיות הופכים אותם לבלתי ניתנים להפרדה עבור מעבדות אקדמיות רבות. מאמר זה מתאר זרימת עבודה של הכנת מדגם פרוטאומיקה באמצעות מערכת אוטומציה של קוד פתוח במחיר סביר (The Opentrons OT-2), כולל הוראות להגדרת הפחתת חלבון אוטומטית למחצה, אלקילציה, עיכול וניקוי; כמו גם נלווה סקריפטים Python קוד פתוח לתכנת את מערכת OT-2 באמצעות ממשק תכנות היישומים שלה.
Introduction
פרוטאומיקה של רובה ציד מבוסס ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה למדידת השפע של חלבונים רבים בדגימות ביולוגיות בו זמנית. ניסויי פרוטאומיקה בניתוח ביואינפורמטיקה משמשים באופן שגרתי לזיהוי סמנים ביולוגיים ולגלות מתחמים ביולוגיים ומסלולים הקשורים העומדים בבסיס מנגנונים פתולוגיים. עם הספציפיות האנליטית הגבוהה שלה ודיוק כמותי פוטנציאלי, פרוטאומיקה רובה ציד יש גם פוטנציאל מצוין להיות מאומץ על ידי מתקני מחקר ומעבדות אבחון לניתוח מדגם קליני ללא צורך להסתמך על נוגדנים1,2.
כדי להכין דגימות חלבון לניתוח פרוטאומיקה של רובה ציד, חלבונים המופקים מדגימות ביולוגיות (למשל, תאים ורקמות) בדרך כלל צריכים להיות מעובדים תחילה באמצעות פרוטוקולים ארוכים, כולל מדידת ריכוז החלבון לדוגמה, הפחתת חלבון ואלקלציה, ועיכול אנזימטי לפפטידים. יתר על כן, חלבונים המופקים במאגרי תמוגה נפוצים המכילים חומרי ניקוי דורשים לעתים קרובות שלבים נוספים של חילופי חוצץ או הסרת חומרי ניקוי לפני הניתוח מכיוון שדטרגנט יכול להפריע לעיכול טריפסין ולפגוע באופן משמעותי בביצועים של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית במורד הזרם (ניתוח LC-MS /MS)3. פפטידים הם בדרך כלל מותפלים עוד יותר, מיובשים, ומחודשים בממסים תואמי LC-MS / MS בעקבות עיכול אנזימטי. הליכי ביוכימיה חלבונים אלה יכולים להיות עתירי עבודה וגוזלים זמן רב. לכן, הם ממשיכים להגביל את התפוקה של זרימות עבודה של פרוטאומיקה ולתרום לשונות של נתונים שנרכשו4,5. טעויות אנוש והטיות הוכרו כגורמים מכריעים המשפיעים על שונות הנתונים ועל רבייה6,7. כדי למזער טעויות אנוש בתהליכי עבודה של הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה, נעשה שימוש במערכות רובוטיות אוטומטיות של צינורות כדי לשפר את התפוקה והשחזור של זיהוי חלבונים וכימות מפרוטאומיקה של רובה ציד וניתוח ספקטרומטריית מסה ממוקדת, שם התפתחויות כאלה הוכרזו כמסייעות להמשך הדחיפה לאימוץ נרחב של טכנולוגיות פרוטאומיקה במחקר קריטי ובהגדרות קליניות8, 9,10,11,12,13. עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים בפלטפורמות רובוטיות לטיפול בנוזלים הדורשים השקעה והכשרה משמעותיות, ומגבילים את התועלת שלהם במעבדות רבות בסביבה האקדמית או בכל דרך אחרת עם תקציב מוגבל.
מאמר זה מתאר פרוטוקול המשתמש במערכת טיפול בנוזל רובוטי רובוטי בקוד פתוח בעלות נמוכה, OT-2, כדי להפוך חצי אוטומטית זרימת עבודה טיפוסית להכנת מדגם רובה ציד פרוטאומיקה. ל-OT-2 יש עלות נמוכה יותר ממערכות רבות אחרות לטיפול בנוזלים רובוטיים, ובזמן הכתיבה, הוא עולה כ-5,000 דולר אמריקאי. כאשר לוקחים בחשבון את המחירים של מודולים שונים ותוכנות מעבדה, העלות הכוללת להגדרת ניסויים בפרוטוקול זה בזמן הכתיבה היא סביב $10,000, מה שהופך אותו זול יותר לקבוצה רחבה בהרבה של מעבדות על פני אפשרויות יקרות יותר. ה- OT-2 תואם לתכנות קוד פתוח באמצעות סקריפטים של Python ומציע גמישות רבה בעיצוב פרוטוקול עשה זאת בעצמך המוגדר על-ידי המשתמש. באמצעות שלושה סקריפטים שפותחו בתוך הבית, הפרוטוקולים להלן מכסים ביצוע זרימת עבודה טיפוסית של הכנת דגימת פרוטאומיקה של רובה ציד בתחנת OT-2 עם תקן חלבון ארכיטיפי (אלבומין סרום בקר; BSA) ודגימת חלבון מורכבת של ליסט לב אנושי רגיל (איור 1). ההליכים לעיבוד (1) דגימת BSA ו-(2) דגימת ליסט לב מורכבת מפורטים בפרוטוקול סעיפים 1, 2, 5, 6 ו-3, 4, 5, 6, 6, בהתאמה. חרוזים מגנטיים שעברו שינוי קרבוקסילציה Sera-Mag מנוצלים בהכנת מדגם משופרת של שלב מוצק בסיר אחד (SP3) להסרת חומרי ניקוי ומלחים בדגימות החלבון והפפטיד. תקצירים טריפטיים מאלבומין בסרום בקר וחלבוני לב אנושיים מנוקים עוד יותר על ידי חרוזי SP3 ומוגשים לניתוח LC-MS/MS. ספקטרום המסה מנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת MaxQuant לזיהוי פפטיד וחלבון. תוצאות מייצגות המבוצעות על ידינו מראות כי הפרוטוקול משיג מקדמים טכניים מצוינים של וריאציה (CV) תוך חיסכון בזמן הספסל ואינו נחות לעיכול ידני.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש להשתמש בתוכנות מעבדה מאומתות של Opentrons, מודולים וחומרים מתכלים התואמים ל- OT-2. תוכנות מעבדה מותאמות אישית ניתן ליצור בעקבות ההוראה של Opentrons ב Reference14. הקפד לכייל את סיפון OT-2, פיפטות, ו labware בעת שימוש בפעם הראשונה. זה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F32-HL14919191 ל- YH; R00-HL144829 לאל על; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 ל- MPL. איור 1, איור 2, איור 3 נוצרים בעזרת כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
