오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리
Summary
상세한 프로토콜과 3개의 Python 스크립트는 광원 로봇 액체 처리 시스템을 운영하여 세제 제거, 단백질 소화 및 펩타이드 탈염 단계를 포함하는 대량 분광 실험에 대한 반자동 단백질 샘플 준비를 수행하기 위해 제공됩니다.
Abstract
질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스 실험은 효소 단백질 소화 및 정리를 포함한 여러 샘플 준비 단계가 필요하며, 이는 상당한 시간의 벤치 노동을 수용하고 배치 대 배치 가변성의 원천을 제시할 수 있습니다. 파이펫팅 로봇을 통한 실험실 자동화는 수동 작업을 줄이고, 처리량을 최대화하며, 연구 재현성을 높일 수 있습니다. 여전히, 표준 자동화 스테이션의 가파른 시작 가격은 많은 학술 실험실에 대한 저렴한 합니다. 이 문서에서는 반자동 단백질 감소, 알킬레이션, 소화 및 정화 단계를 설정하는 지침을 포함하여 저렴한 오픈 소스 자동화 시스템(Opentrons OT-2)을 사용하여 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우에 대해 설명합니다. 뿐만 아니라 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 통해 OT-2 시스템을 프로그래밍하는 오픈 소스 파이썬 스크립트를 동반.
Introduction
질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스는 생물학적 시료에 많은 단백질의 풍부를 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 생물 정보학 분석을 사용한 프로테오믹스 실험은 일상적으로 생체 마커를 식별하고 병리학 적 메커니즘을 뒷받침하는 관련 생물학적 복합체 및 경로를 발견하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 높은 분석 특이성 및 잠재적 정량적 정확도를 갖춘 산탄총 프로테오믹스는 항체에 의존할 필요 없이 임상 샘플 분석을 위한 연구 시설 및 진단 실험실에서 채택될 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있습니다1,2.
산탄총 프로테오믹스 분석을 위한 단백질 샘플을 준비하려면 생물학적 샘플(예: 세포 및 조직)에서 추출한 단백질은 일반적으로 시료 단백질 농도, 단백질 감소 및 알킬레이션 측정, 펩타이드로효소 소화 를 측정하는 것을 포함하여 긴 프로토콜을 사용하여 처리되어야 합니다. 더욱이, 세제를 함유하는 일반적인 용해 완충제에서 추출된 단백질은 종종 세제가 트립신 소화를 방해하고 다운스트림 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석3의 성능을 현저히 저하시킬 수 있기 때문에 분석 전에 완충교환 또는 세제 제거의 추가 단계가 필요합니다. 펩타이드는 전형적으로 효소 소화에 따른 LC-MS/MS 호환 용매에서 더 탈염, 건조 및 재구성된다. 이러한 단백질 생화학 절차는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 프로테오믹스 워크플로우의 처리량을 계속 제한하고 획득한 data4,5의 가변성에 기여합니다. 인간의 오류와 편견은 데이터 분산 및 재현성에 영향을 미치는 중요한 요인으로 인식되어 왔습니다6,7. 대량 분광샘플 준비 워크플로우에서 인간의 오류를 최소화하기 위해, 자동화된 파이펫팅 로봇 시스템은 산탄총 프로테오믹스및 표적 질량 분광분석에서 단백질 식별 및 정량화의 처리량 과 재현성을 개선하기 위해 활용되었으며, 이러한 발전은 연구 및 임상 설정에서 중요한 프로테오믹스 기술의 광범위한 채택을 계속하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 9,10,11,12,13. 그러나 대부분의 기존 프로토콜은 상당한 투자와 교육이 필요한 로봇 액체 처리 플랫폼을 활용하여 학업 환경이나 제한된 예산으로 많은 실험실에서 유틸리티를 제한합니다.
이 문서에서는 일반적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 반 자동화하기 위해 저렴한 오픈 소스 로봇 액체 처리 시스템인 OT-2를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. OT-2는 다른 많은 로봇 액체 처리 시스템보다 비용이 낮으며 작성 시 약 5,000 달러의 비용이 듭니다. 다른 모듈 과 labware의 가격을 고려할 때, 쓰기 의 시간에이 프로토콜에 실험을 설정하는 총 비용은 약 $10,000, 이는 더 비싼 옵션을 통해 실험실의 상당히 넓은 세트에 더 저렴 렌더링. OT-2는 파이썬 스크립트를 통한 오픈 소스 프로그래밍과 호환되며 사용자 정의 DIY 프로토콜 설계에서 뛰어난 유연성을 제공합니다. 사내 개발된 3개의 스크립트를 사용하여, 아래 프로토콜은 정형 단백질 표준(소 혈청 알부민)을 가진 OT-2 스테이션에서 전형적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 실행한다. BSA) 및 정상적인 인간 심장 리자테의 복잡한 단백질 샘플(도 1). (1) BSA 샘플 및 (2) 복잡한 심장 용해 샘플을 처리하는 절차는 각각 프로토콜 섹션 1, 2, 5, 6 및 3, 4, 5, 6에 상세합니다. 세라-매그 카복틸레이트 변형 마그네틱 비즈는 단백질 및 펩타이드 샘플에서 세제 및 염을 제거하기 위해 단일 냄비 고체 상 강화 시료 제제(SP3)에 활용된다. 소 세럼 알부민과 인간의 심장 단백질의 트립틱 소화는 SP3 구슬에 의해 더 세척되고 LC-MS/MS 분석을 위해 제출됩니다. 질량 스펙트럼은 펩티드 및 단백질 식별을 위한 MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 당사가 수행한 대표적인 결과는 프로토콜이 벤치 시간을 절약하면서 우수한 기술적 계수(CV)를 달성하고 손다이에 열등하지 않은 것으로 나타났습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내의 중요한 단계
최상의 성능을 위해 OT-2와 호환되는 Opentrons 검증 된 labware, 모듈 및 소모품을 사용해야합니다. 사용자 지정 랩웨어는 Reference14에서 Opentrons의 지시에 따라 만들 수 있습니다. 처음으로 사용할 때 OT-2 데크, 파이펫 및 랩웨어를 교정해야 합니다. 또한 펩티드와 단백질 정화를 위한 구슬을 준비하기 위해 SP3 구슬 제조업체의 지침을 따르는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 상 F32-HL149191YH에 의해 부분적으로 지원되었다; R00-HL144829 – EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 – MPL. 도 1, 도 2, 도 3 은 웹 기반 과학 일러스트 도구인 BioRender.com 사용하여 만들어집니다.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
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