Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto
Summary
Protocolo detalhado e três scripts Python são fornecidos para operar um sistema de manuseio líquido robótico de código aberto para realizar a preparação semi-automatizada de amostras de proteína para experimentos de espectrometria de massa, cobrindo a remoção de detergentes, digestão de proteínas e etapas de desalização de peptídeos.
Abstract
Experimentos de proteômica de espingarda à base de espectrometria em massa requerem múltiplas etapas de preparação de amostras, incluindo digestão e limpeza de proteínas enzimáticas, que podem ocupar horas significativas de trabalho de banco e apresentar uma fonte de variabilidade em lote. A automação de laboratório com robôs de pipetting pode reduzir o trabalho manual, maximizar o throughput e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa. Ainda assim, os preços iniciais acentuados das estações de automação padrão as tornam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos. Este artigo descreve um fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica usando um sistema de automação de código aberto acessível (The Opentrons OT-2), incluindo instruções para a configuração de redução de proteínas semi-automatizadas, alquilação, digestão e etapas de limpeza; além de acompanhar scripts Python de código aberto para programar o sistema OT-2 através de sua interface de programação de aplicativos.
Introduction
A proteômica da espingarda baseada em espectrometria em massa é uma ferramenta poderosa para medir a abundância de muitas proteínas em amostras biológicas simultaneamente. Experimentos proteômicos com análise bioinformática são rotineiramente empregados para identificar biomarcadores e descobrir complexos biológicos associados e caminhos que sustentam mecanismos patológicos. Com sua alta especificidade de analito e potencial precisão quantitativa, a proteômica da espingarda também tem excelente potencial para ser adotada por instalações de pesquisa e laboratórios de diagnóstico para análise de amostras clínicas sem a necessidade de contar com anticorpos1,2.
Para preparar amostras proteicas para análise de proteômica de espingarda, proteínas extraídas de amostras biológicas (por exemplo, células e tecidos) normalmente precisam ser processadas usando protocolos longos, incluindo medir a concentração de proteínas amostrais, redução de proteínas e alquilação, e digestão enzimática em peptídeos. Além disso, proteínas extraídas em tampões de lise comuns contendo detergentes muitas vezes requerem etapas adicionais de troca de buffer ou remoção de detergente antes da análise, pois o detergente pode interferir na digestão de trippsina e degradar significativamente o desempenho da análise de espectrometria de massa líquida a jusante (LC-MS/MS). Os peptídeos são tipicamente mais dessacados, secos e reconstituídos em solventes compatíveis com LC-MS/MS após a digestão enzimática. Esses procedimentos de bioquímica proteica podem ser intensivos em mão-de-obra e demorados. Assim, continuam a limitar o throughput de fluxos de trabalho proteômicos e contribuem para a variabilidade dos dados adquiridos4,5. Erros e vieses humanos têm sido reconhecidos como fatores cruciais que afetam a variância e a reprodutibilidade dos dados6,7. Para minimizar os erros humanos nos fluxos de trabalho de preparação de amostras de espectrometria de massa, sistemas robóticos automatizados de pipetação têm sido utilizados para melhorar o throughput e a reprodutibilidade da identificação e quantificação de proteínas a partir de proteômica de espingarda e análise de espectrometria de massa direcionada, onde tais avanços têm sido saudados como instrumentais para a continuação da adoção generalizada de tecnologias de proteômica em pesquisas críticas e configurações clínicas8, 9,10,11,12,13. No entanto, a maioria dos protocolos existentes utiliza plataformas robóticas de manuseio de líquidos que requerem investimento e treinamento substanciais, limitando sua utilidade em muitos laboratórios no ambiente acadêmico ou de outra forma com um orçamento limitado.
Este artigo descreve um protocolo que utiliza um sistema de manuseio líquido robótico de baixo custo e de código aberto, o OT-2, para semi-automatizar um típico fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica de espingarda. O OT-2 tem um custo menor do que muitos outros sistemas robóticos de manuseio líquido, e no momento da escrita, custa aproximadamente US $ 5.000 dólares americanos. Ao considerar os preços de diferentes módulos e labware, o custo total para configurar experimentos neste protocolo no momento da escrita é de cerca de US $ 10.000, o que o torna mais acessível a um conjunto consideravelmente mais amplo de laboratórios sobre opções mais caras. O OT-2 é compatível com a programação de código aberto através de scripts Python e oferece grandes flexibilidades no design do protocolo DIY definido pelo usuário. Usando três scripts desenvolvidos internamente, os protocolos abaixo cobrem a execução de um fluxo de trabalho típico de preparação de amostras de proteômica de espingarda na estação OT-2 com um padrão de proteína arquetípico (albumina de soro bovino; BSA) e uma amostra de proteína complexa de um liseto cardíaco humano normal (Figura 1). Os procedimentos de processamento (1) uma amostra de BSA e (2) uma amostra complexa de liseto cardíaco estão detalhados nas seções de Protocolo 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6, respectivamente. As contas magnéticas modificadas por carboxilato sera-mag são utilizadas na preparação de amostras aprimoradas em fase sólida (SP3) para remover detergentes e sais nas amostras de proteína e peptídeo. Digestões trippticas da albumina de soro bovino e proteínas cardíacas humanas são ainda mais limpas por contas SP3 e submetidas à análise LC-MS/MS. Os espectros de massa são então analisados usando o software MaxQuant para identificação de peptídeos e proteínas. Os resultados representativos realizados por nós mostram que o protocolo alcança excelentes coeficientes técnicos de variação (CV) enquanto economiza tempo de bancada e não é inferior ao digestor manual.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do protocolo
Para o melhor desempenho, devem ser utilizados labware, módulos e consumíveis compatíveis com OT-2. O labware personalizado pode ser criado seguindo as instruções do Opentrons no Reference14. Certifique-se de calibrar o deck OT-2, pipetas e labware quando usado pela primeira vez. Também é fundamental seguir as diretrizes do fabricante de contas SP3 para preparar contas para peptídeos e limpeza de proteínas. Notavelmente, durante a r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pelos prêmios NIH F32-HL149191 para YH; R00-HL144829 para EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 para MPL. Figura 1, Figura 2, Figura 3 são criadas com o auxílio de uma ferramenta de ilustração científica baseada na Web, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
