La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Summary

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un’analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

Abstract

Le attuali innovazioni terapeutiche, come la terapia cellulare CAR-T, dipendono fortemente dalla somministrazione genica mediata da virus. Sebbene efficiente, questa tecnica è accompagnata da elevati costi di produzione, che hanno suscitato un interesse nell’utilizzo di metodi alternativi per la consegna genica. L’elettroporazione è un approccio elettrofisico non virale per la consegna intracellulare di geni e altri materiali esogeni. Dopo l’applicazione di un campo elettrico, la membrana cellulare consente temporaneamente la consegna molecolare nella cellula. Tipicamente, l’elettroporazione viene eseguita su macroscala per elaborare un gran numero di cellule. Tuttavia, questo approccio richiede un ampio sviluppo di protocolli empirici, che è costoso quando si lavora con tipi di cellule primarie e difficili da trasfettare. Il lungo sviluppo del protocollo, insieme alla necessità di grandi tensioni per ottenere sufficienti intensità di campo elettrico per permeabilizzare le celle, ha portato allo sviluppo di dispositivi di elettroporazione su microscala. Questi dispositivi di micro-elettroporazione sono fabbricati utilizzando tecniche di microfabbricazione comuni e consentono un maggiore controllo sperimentale con il potenziale di mantenere elevate capacità di produttività. Questo lavoro si basa su una tecnologia di elettroporazione microfluidica in grado di rilevare il livello di permeabilizzazione della membrana cellulare a livello di singola cellula in un flusso continuo. Tuttavia, questa tecnologia è stata limitata a 4 celle elaborate al secondo, e quindi un nuovo approccio per aumentare il throughput del sistema è proposto e presentato qui. Questa nuova tecnica, indicata come controllo di feedback basato sulla popolazione cellulare, considera la risposta di permeabilizzazione cellulare a una varietà di condizioni di impulso dell’elettroporazione e determina le condizioni di impulso di elettroporazione più adatte per il tipo di cellula in esame. Viene quindi utilizzata una modalità a throughput più elevato, in cui questo impulso “ottimale” viene applicato alla sospensione cellulare in transito. I passaggi per fabbricare il dispositivo, impostare e gestire gli esperimenti microfluidici e analizzare i risultati sono presentati in dettaglio. Infine, questa tecnologia di micro-elettroporazione è dimostrata fornendo un plasmide del DNA che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule HEK293.

Introduction

Le attuali innovazioni terapeutiche nella ricerca biomedica, come la terapia cellulare CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e l’editing genetico utilizzando CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNA sequences) / Cas9, si basano fortemente sulla capacità di fornire materiale esogeno sia con successo che in modo efficiente nello spazio intracellulare¹. Nella terapia CAR-T, il gold standard per eseguire la fase di consegna genica nella produzione di terapia cellulare è l’utilizzo di vettori virali². Sebbene la consegna genica mediata da virus sia una modalità di consegna efficiente, presenta anche diversi inconvenienti. Questi includono i costi di produzione, la citotossicità, l’immunogenicità, il potenziale di mutagenesi/tumorigenesi e le limitazioni delle dimensioni dei geni da somministrare³. Queste limitazioni hanno portato alla ricerca e allo sviluppo di tecnologie di somministrazione alternative e non virali.

L’elettroporazione, un’alternativa alla consegna genica mediata da virus, si basa sull’applicazione di una forma d’onda di impulso elettrico ottimale per eseguire trasfezioni di DNA, RNA e proteine delle cellule. A seguito dell’applicazione di un campo elettrico esterno, la membrana cellulare viene brevemente compromessa, rendendo la cellula suscettibile alla consegna intracellulare di materiali esogeni altrimenti impermeabili⁴. Rispetto alla somministrazione mediata da virus, l’elettroporazione è vantaggiosa in quanto è generalmente sicura, facile da usare e ha bassi costi operativi. L’elettroporazione può trasportare sia piccoli che grandi carichi molecolari e può essere efficiente nel trasfettare le cellule indipendentemente dal lignaggio⁵. Per ottenere risultati desiderabili dopo l’elettroporazione, cioè una buona vitalità e una buona efficienza di elettro-trasfezione, una varietà di parametri sperimentali deve essere co-ottimizzata. Questi includono il tipo di cella⁶, la densità cellulare, la concentrazione della molecola⁷, le proprietà del tampone di elettroporazione (ad esempio, composizione molecolare, conducibilità e osmolarità)⁸, dimensione/geometria dell’elettrodo⁹ e forma d’onda dell’impulso elettrico (forma, polarità, numero di impulsi)¹⁰ (fare riferimento alla Figura 1 per un’illustrazione). Sebbene ciascuno di questi parametri possa avere un effetto significativo sui risultati degli esperimenti di elettroporazione, la forma d’onda dell’impulso è stata studiata in modo particolarmente dettagliato, poiché l’energia elettrica degli impulsi applicati è la radice del compromesso intrinseco tra la vitalità cellulare risultante e l’efficienza di elettro-trasfezione⁸.

Tipicamente, gli esperimenti di elettroporazione vengono eseguiti su macro-scala, dove le celle sono sospese in 100 microlitri di tampone tra una serie di grandi elettrodi a piastra parallela all’interno di una cuvetta di elettroporazione. Gli elettrodi sono comunemente fabbricati in alluminio con una distanza dell’elettrodo di 1-4 mm. Una volta che le celle vengono caricate manualmente tramite pipetta, la cuvetta è collegata elettricamente a un ingombrante generatore di impulsi elettrici in cui l’utente può impostare e applicare i parametri della forma d’onda dell’impulso per elettropolare la sospensione della cella. Sebbene l’elettroporazione su macroscala o di massa possa elaborare densità cellulari >10⁶ celle/ml, questa funzione può essere dispendiosa quando si ottimizzano le impostazioni della forma d’onda dell’impulso elettrico. Ciò è particolarmente preoccupante quando si elettroporano tipi di cellule primarie in cui il numero di popolazioni cellulari può essere limitato. Inoltre, a causa della grande distanza tra gli elettrodi, il generatore di impulsi deve essere in grado di fornire grandi tensioni per ottenere intensità di campo elettrico >1kV / cm¹¹. Queste alte tensioni causano una dissipazione di potenza resistiva attraverso il tampone elettrolitico con conseguente riscaldamento Joule, che può essere dannoso per la vitalità della cella risultante¹². Infine, l’esecuzione dell’elettroporazione su una sospensione densa di cellule sarà costantemente gravata da una variabilità innata nell’efficienza di elettro-trasfezione risultante e nella vitalità cellulare. Ogni cellula in sospensione potrebbe sperimentare una diversa intensità del campo elettrico a causa delle cellule circostanti. A seconda che l’intensità del campo elettrico sperimentato sia aumentata o diminuita, la vitalità cellulare risultante o l’efficienza di elettro-trasfezione possono essere influenzate negativamente¹¹. Questi aspetti negativi dell’elettroporazione su macro-scala hanno portato alla ricerca e allo sviluppo di tecnologie alternative che operano su micro-scala e consentono un migliore controllo a livello di singola cella.

Il campo dei BioMEMS, o sistemi biomedici micro-elettro-meccanici, deriva dai progressi tecnologici compiuti nel settore della microelettronica. In particolare, utilizzando processi di microfabbricazione per sviluppare micro-dispositivi per il progresso della ricerca biomedica. Questi progressi includono lo sviluppo di array di micro-elettrodi per il monitoraggio elettrico in vivo¹³, micro-elettrodi capacitivi per elettroporazione in situ 14, dispositivi miniaturizzati organ-on-a-chip 15, diagnostica microfluidica point-of-care 16, biosensori 17 e sistemi di somministrazione di farmaci 18, compresi dispositivi di nano e micro-elettroporazione ^19,20,21 . Grazie alla capacità di progettare e produrre dispositivi alla stessa scala dimensionale delle celle biologiche, le tecnologie di nano e micro-elettroporazione sono vantaggiose rispetto alla loro controparte su macroscala^22,23. Questi dispositivi di elettroporazione eliminano la necessità di applicazioni a impulsi ad alta tensione, poiché i set di elettrodi con spaziature da 10 a 100 secondi di micrometri sono tipicamente integrati. Questa caratteristica riduce drasticamente la corrente attraverso l’elettrolita, che a sua volta riduce l’accumulo di prodotti di elettrolisi tossici e gli effetti del riscaldamento Joule in questi sistemi. I canali su microscala assicurano inoltre che un campo elettrico molto più uniforme venga applicato in modo affidabile alle celle durante l’applicazione dell’impulso, con risultati più coerenti²⁴. Inoltre, è anche normale che i dispositivi di microelettroporazione siano integrati in una piattaforma microfluidica che si presta per la futura integrazione in una tecnologia completamente automatizzata, una capacità altamente auspicabile nella produzione di terapie cellulari²⁵. Infine, l’elettroporazione su microscala consente l’interrogazione elettrica degli eventi di elettroporazione. Ad esempio, il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare può essere monitorato in tempo reale a livello di singola cellula^26,27. Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere la microfabbricazione, il funzionamento del sistema e l’analisi di un dispositivo microfluidico di microelettroporazione monocellulare in grado di misurare il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare per ottimizzare i protocolli di elettroporazione, aumentando al contempo la produttività rispetto al precedente stato dell’arte.

L’esecuzione dell’elettroporazione a livello di singola cellula non è più una tecnica nuova, come è stato dimostrato per la prima volta da Rubinsky et al. nel 2001 con lo sviluppo di una tecnologia di elettroporazione a celle statiche²⁸. Il loro micro-dispositivo è stato innovativo in quanto sono stati i primi a dimostrare la capacità di monitorare elettricamente l’evento di elettroporazione. Ciò ha ulteriormente portato allo sviluppo di tecnologie statiche di elettroporazione a cella singola in grado di rilevare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in modo parallelizzato per aumentare la produttività dei dispositivi. Tuttavia, anche con la parallelizzazione e l’elaborazione batch, questi dispositivi mancano gravemente del numero totale di celle che possono elaborare per unità di tempo^29,30. Questa limitazione ha portato allo sviluppo di dispositivi flow-through in grado di eseguire microelettroporazione a livello di singola cella a portate molto maggiori³¹. Questa transizione del dispositivo, dall’ambiente statico a quello flow-through, limita la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in seguito all’applicazione dell’impulso di elettroporazione. Il metodo descritto in questo lavoro colma il divario tra queste due tecnologie, una tecnologia di micro-elettroporazione in grado di rilevare, pulsare e monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare delle singole cellule, in modo seriale a flusso continuo.

Questa tecnologia è stata recentemente descritta in Zheng et al. In quel lavoro, le capacità di questa tecnologia sono state introdotte con il completamento di uno studio parametrico, in cui sono state variate sia l’ampiezza che la durata dell’impulso di elettroporazione, e il conseguente segnale elettrico, indicativo della permeabilizzazione della membrana cellulare, è stato esplorato³². I risultati hanno mostrato che un aumento dell’intensità dell’impulso di elettroporazione (cioè aumento del campo elettrico applicato o aumento della durata dell’impulso) ha causato un aumento della permeabilizzazione della membrana cellulare misurata. Per convalidare ulteriormente il sistema, un indicatore fluorescente comune di elettroporazione riuscita, lo ioduro di propidio³³, è stato aggiunto alla sospensione cellulare e un’immagine di fluorescenza è stata acquisita immediatamente dopo l’applicazione dell’impulso elettrico. Il segnale ottico, cioè l’intensità di fluorescenza dello ioduro di propidio all’interno della cellula, è stato fortemente correlato con la misura elettrica del grado di permeabilizzazione della membrana cellulare, verificando l’affidabilità di questa misura elettrica. Tuttavia, questo lavoro ha considerato solo la consegna della piccola molecola ioduro di propidio, che ha poco o nessun significato traducibile.

In questo lavoro, viene introdotta una nuova applicazione di questa tecnologia per migliorare la produttività del sistema, fornendo al contempo un vettore di DNA plasmidico biologicamente attivo (pDNA) e valutando l’efficienza di elettro-trasfezione delle cellule riplaccate e coltivate dopo l’elettroporazione. Sebbene il lavoro precedente superi le tecnologie di micro-elettroporazione esistenti che sono in grado di misurare elettricamente l’evento di elettroporazione, lo stato attuale del dispositivo richiede ancora lunghi tempi di transito della cella tra il set di elettrodi (~ 250 ms) per eseguire il rilevamento cellulare, l’applicazione dell’impulso e la misurazione della permeabilizzazione della membrana cellulare. Con un singolo canale, questo limita il throughput a 4 celle/s. Per combattere questa limitazione, viene introdotto un nuovo concetto di elettroporazione controllata da feedback basata sulla popolazione cellulare per eseguire l’elettro-trasfezione del pDNA. Utilizzando un tampone di elettroporazione a conducibilità ipofisiologica, questo sistema consente l’interrogazione elettrica di singole celle attraverso una moltitudine di applicazioni di impulsi di elettroporazione. Sulla base della risposta elettrica, viene quindi determinato un impulso di elettroporazione “ottimale”. Viene quindi implementata una modalità “high-throughput” in cui la determinazione della permeabilizzazione della membrana cellulare viene annullata, la portata viene aumentata e il duty cycle dell’impulso di elettroporazione viene abbinato al tempo di transito della cella per garantire un impulso per cella in transito tra gli elettrodi. Questo lavoro fornirà ampi dettagli sulle fasi di microfabbricazione per la produzione del micro-dispositivo, il materiale / attrezzatura e la loro configurazione necessaria per eseguire la sperimentazione, e il funzionamento / analisi del dispositivo e la sua efficienza di elettro-trasfezione (eTE).

Figura 1: Fattori sperimentali che influenzano i risultati dell’elettroporazione. (Sinistra) Sospensione cellulare: i fattori importanti da considerare prima dell’inizio dell’elettroporazione includono: carico utile (in questo caso, pDNA), concentrazione, densità cellulare e proprietà del tampone di elettroporazione. Le proprietà del tampone di elettroporazione da considerare sono la conduttività, l’osmolarità e l’esatta composizione molecolare che contribuisce a questi valori. (Al centro) Applicazione dell’impulso – Il tipo di impulso esatto (onda quadra vs. decadimento esponenziale) e la forma d’onda dell’impulso (singolo impulso vs. treno di impulsi) devono essere ottimizzati per massimizzare sia la vitalità cellulare risultante che l’efficienza di elettro-trasfezione. I treni di impulsi comuni implementati nei processi di elettroporazione sono tipicamente composti da una serie di impulsi ad alta tensione (HV) o serie di impulsi che ruotano tra le grandezze di impulso HV e bassa tensione (BT). (Destra) Le fasi di elaborazione a valle del recupero cellulare, in particolare i terreni di coltura cellulare di recupero in cui le cellule vengono trasferite, dovrebbero essere ottimizzati. Non in primo piano (estrema sinistra), è possibile implementare ulteriori fasi di elaborazione delle celle a monte per l’ottimizzazione complessiva del processo di elettroporazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

NOTA: gli utenti devono esaminare tutte le schede di sicurezza per i materiali e i materiali di consumo utilizzati in questo protocollo. In ogni fase devono essere indossati DPI appropriati e durante la sperimentazione deve essere utilizzata una tecnica sterile. Le sezioni 1-7 illustrano la fabbricazione del dispositivo. 1. Fabbricazione del dispositivo – Design della maschera NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per un’i…

Representative Results

La figura 4 evidenzia i principi operativi alla base del rilevamento della permeabilizzazione della membrana a livello di singola cellula per un’ampiezza di impulso singolo. Dopo l’avvio dell’esperimento di elettroporazione, l’algoritmo di rilevamento cellulare determina una soglia ottimale per il rilevamento delle cellule tramite un metodo di rilevamento punto per punto, basato sulla pendenza. Il sistema monitora quindi continuamente (1) una variazione negativa significativa della corrente …

Discussion

La metodologia presentata all’interno di questo protocollo si concentra principalmente sulla microfabbricazione di un dispositivo microfluidico che viene poi integrato in una configurazione sperimentale di elettroporazione specializzata. Il termine “ricetta”, che viene spesso utilizzato quando si descrivono le specifiche del processo di microfabbricazione, suggerisce l’importanza di seguire / ottimizzare ogni fase per fabbricare con successo un dispositivo funzionante. Tuttavia, alcune fasi critiche all’interno del proce…

Materials

150-mm diameter petri dishes	VWR	25384-326	step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture plates	VWR	10062-896	step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generator	Agilent		step 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafers	University Wafer		subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture plates	VWR	10062-892	step 8.1.8 to plate cells
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter		steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018	Autodesk		subsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1	VWR	901621-1L	subsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope camera	Hamamatsu	Orca 285 C4742-96-12G04	step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP	PCO		subsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive Epoxy	CircuitWorks	CW2400	subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C	step 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface Profilometer	Veeco (Sloan/Dektak)		step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mm	Robbins Instruments	RBP075	step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mm	Robbins Instruments	RBP30P	step 6.2.3 for outlet access
DRAQ5	abcam	ab108410	step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	ThermoFisher Scientific	11885084	step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supply	Agilent		step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscope	Nikon		subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography System	EVG		step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine Serum	Neuromics	FBS001	step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific		subsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mL	Fisher Scientific	FB800100	step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mL	Fisher Scientific	FB800500	step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell line	ATCC	CRL-1573	subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solution	Sigma Aldrich	83264-100ML-F	step 8.2.1 part of electroporation buffer composition
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	379212-25ML	step 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurich Instruments		subsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifier	Zurich Instruments		subsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl Alcohol	Fisher Scientific	A459-1	step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscope	Olympus		step 11.2.3 for imaging
L-Glutamine Solution	Sigma Aldrich	G7513-20ML	step 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wire	AWC	B22-1	subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	208337-100G	step 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 Developer	Kayaku Advanced Materials	10018042	step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresist	Kayaku Advanced Materials	1136925	step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mm	VWR	16004-422	step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifier	TEGAM	2350	step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEW	National Instruments		data acquisition
Needle, 30G x 1 in	BD Scientific	305128	step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuit	Digi-key	598-1330-ND	Part of the custom circuit
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458-20ML	step 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFP	Lonza	VCA-1003	step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030"	VWR	89404-300	step 10.1.2. for system priming
Platinum targets	Kurt J. Lesker		subsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333-500G	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump	Harvard Apparatus	MA1 70-2213	step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition system	Kurt J. Lesker		subsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner System	Headway Research		steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment system	March Instruments		subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generator	Siglent		step 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S8045-500G	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresist	Kayaku Advanced Materials	Y111053	step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developer	Microchem	Y010200	step 2.1.12. for photoresist developing
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903-1KG	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 ml	BD Scientific	309628	step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope System	Olympus		subsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 Flasks	Falcon	353108	step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targets	Kurt J. Lesker		subsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masks	CAD/ART Services		steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G	step 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solution	Sigma Aldrich	T4049-100ML	steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting