मानव दंत कूप से उपकला कोशिकाओं का अलगाव
Summary
दंत कूप में एक उपकला आबादी और मेसेनकाइमल कोशिकाएं होती हैं। उपकला आबादी को एक अलग संस्कृति माध्यम प्रदान करके विषम दंत कूप सेल आबादी से चुना गया था। उपकला कोशिकाएं बच गईं और सीरम-मुक्त माध्यम में उपनिवेशों का गठन किया।
Abstract
दंत कूप (डीएफ) को एक मौखिक मैक्सिलोफेशियल सर्जन द्वारा एक प्रभावित तीसरे दाढ़ को हटाने के दौरान काटा गया था। उपकला सेल अलगाव डीएफ फसल के दिन किया गया था। डीएफ को डीपीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था और फिर ऊतक कैंची के साथ विच्छेदित किया गया था जब तक कि ऊतक में लुगदी या स्क्विशी स्थिरता नहीं थी। एकल-कोशिका आबादी को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पैलेट किया गया था और केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम से धोया गया था। विषम सेल आबादी को एक संस्कृति पकवान में वितरित किया गया था। उपकला कोशिकाओं का चयन करने के लिए केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम का उपयोग किया गया था। संस्कृति माध्यम को दैनिक रूप से बदल दिया गया था जब तक कि कोई फ्लोटिंग मलबे या मृत कोशिकाओं को नहीं देखा गया था। उपकला कोशिकाएं सेल जनसंख्या वितरण के बाद 7-10 दिनों के भीतर दिखाई दीं। उपकला कोशिकाएं सीरम-मुक्त माध्यम में बच गईं, जबकि α-संशोधन न्यूनतम आवश्यक माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ने मेसेनकाइमल-प्रकार की कोशिकाओं के प्रसार की अनुमति दी। डीएफ दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक ऊतक स्रोत है।
इस अध्ययन का उद्देश्य मानव डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि स्थापित करना था। Periodontal स्नायुबंधन (पीडीएल) का उपयोग मानव दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए किया गया था। मानव पीडीएल से उपकला कोशिकाओं की खरीद हमेशा छोटे ऊतक की मात्रा के कारण सफल नहीं होती है, जिससे उपकला कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है। DF में PDL की तुलना में एक बड़ी मात्रा होती है और इसमें अधिक कक्ष होते हैं. डीएफ मानव दंत उपकला कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति के लिए एक ऊतक स्रोत हो सकता है। यह प्रोटोकॉल पीडीएल का उपयोग करके अलगाव विधि की तुलना में आसान और अधिक कुशल है। मानव दंत उपकला कोशिकाओं की खरीद दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के आगे के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकती है।
Introduction
दाँत गठन मौखिक उपकला 1 के invagination के साथ शुरू होता है। दांत विकास के चरण के अनुसार, मौखिक उपकला के अलग-अलग नाम हैं, जिनमें आंतरिक और बाहरी तामचीनी उपकला, ग्रीवा लूप और हर्टविग के उपकला जड़ म्यान (एचईआरएस) शामिल हैं। उपकला डिब्बे आसपास के मेसेनकाइमल कोशिकाओं के साथ संवाद करते हैं। उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन दांतों के गठन और ऊतक पुनर्जनन को विनियमित करते हैं। दंत उपकला कोशिकाओं, जैसे कि मौखिक केराटिनोसाइट्स और हर्टविग के उपकला जड़ म्यान कोशिकाओं (एचईआरएससी) की खरीद, दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन 2 के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है।
कृंतक-व्युत्पन्न दंत उपकला कोशिकाओं को उपकला संरचना से अलग किया जाता है, जैसे कि एचईआरएस। ली और उनके सहयोगियों ने 8-दिन पुराने चूहों से विकासशील दांत रोगाणुओं के एपिकल भाग की कटाई के बाद चूहे दाढ़-व्युत्पन्न HERSCs को अलग और अमर कर दिया। एचईआरएस को आवर्धन के तहत एपिकल ऊतक से अलग किया गया था। दांत विकास के चरण और उम्र को ध्यान में रखते हुए, नैतिक मुद्दों के कारण मनुष्यों से एचईआरएस की कटाई लगभग असंभव है: मानव एचईआरएस की कटाई के लिए एक छोटे बच्चे से एक विकासशील दांत रोगाणु को हटाने की आवश्यकता होती है। अपरिपक्व दांत रोगाणुओं को शायद ही कभी निकाला जाता है। मानव दंत उपकला कोशिकाओं को मसूड़े और periodontal स्नायुबंधन (पीडीएल) से अलग किया जा सकता है। उपकला संरचना-व्युत्पन्न कोशिकाएं मेसेनकाइमल घटकों के साथ दांत गठन में भाग लेती हैं और मौखिक केराटिनोसाइट्स की तुलना में दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकती हैं। उपकला सेल Malassez (ERM) के आराम HERS-व्युत्पन्न उपकला अवशेष हैं और PDL4 में कम संख्या में रहते हैं। अध्ययन PDL5 से मानव HERSCs के अलगाव की रिपोर्ट करते हैं। हालांकि, पीडीएल ऊतक से मानव एचईआरएससी की कटाई हमेशा सफल नहीं होती है क्योंकि इस स्थान में उपकला आबादी की कमी 5,6।
यद्यपि कृंतक-व्युत्पन्न HERSCs को सीरम-युक्त मीडिया 3,7 में बनाए रखा जाता है, मानव डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को सीरम-मुक्त मीडिया के साथ अन्य मानव उपकला कोशिकाओं के समान सुसंस्कृत किया जाता है, जैसे कि सामान्य मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स और सामान्य मानव मौखिक केराटिनोसाइट्स 8,9। इसका तात्पर्य कृंतक दंत उपकला कोशिकाओं और मानव दंत उपकला कोशिकाओं के बीच शारीरिक या कार्यात्मक अंतर से है। दंत उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के बारे में तंत्र को समझना नैदानिक अनुप्रयोगों के विकास में योगदान कर सकता है, जिसमें पुनर्रोपण के दौरान periodontal reattachment, periodontal रोग में periodontal पुनर्जनन, लुगदी-डेंटिन जटिल पुनर्जनन और जैव-दांत पीढ़ी शामिल हैं। ट्रांसलेशनल अनुसंधान की विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, मानव दंत उपकला कोशिकाएं उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए कृंतक दंत उपकला कोशिकाओं की तुलना में अधिक उपयुक्त हो सकती हैं।
मानव डीएफ एक ढीला संयोजी ऊतक है और अक्सर एक प्रभावित दांत में रहता है। DF में मेसेनकाइमल अग्रदूत 10 शामिल हैं। हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, किसी भी अध्ययन ने 2021 से पहले दंत रोम से उपकला कोशिकाओं के अलगाव की सूचना नहीं दी है। ओह और यी ने 20218 में मानव डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव की सूचना दी। उपकला फेनोटाइप की पुष्टि पश्चिमी ब्लोटिंग और आकारिकी विश्लेषण द्वारा की गई थी। डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं की उत्पत्ति के विश्लेषण ने अन्य अध्ययनों के साथ समान परिणामों का प्रदर्शन किया। डीएफ-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाएं न तो एंडोथेलियल थीं और न ही हेमटोपोइएटिक 5,11, और ओह और यी ने इन कोशिकाओं को डीएफ-एचईआरएससी के रूप में नामित करने का सुझाव दिया। डीएफ में पीडीएल की तुलना में एक बड़ी मात्रा होती है, और अधिक उपकला कोशिकाओं को डीएफ से अलग किया जा सकता है। यह उपकला उपनिवेशों के उद्भव को बढ़ाता है और डीएफ से उपकला कोशिकाओं की कटाई में एक उच्च सफलता दर में परिणाम देता है। यह अध्ययन दंत उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए ऊतक स्रोत के रूप में डीएफ का उपयोग करने का सुझाव देता है।
वर्तमान अध्ययन में, एकल कोशिकाओं को पहले से वर्णित प्रक्रियाओं 10,12 के अनुसार डीएफ से अलग किया गया था। डीएफ में विषम सेल आबादी होती है, और प्रक्रिया के शुरुआती चरण में कई सेल प्रकार मौजूद हो सकते हैं। Morsczek और सहयोगियों ने DF-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को अलग किया। हमने परिकल्पना की है कि डीएफ में उपकला कोशिकाएं होती हैं और केवल उपकला कोशिकाएं सीरम-मुक्त स्थितियों के तहत जीवित रह सकती हैं। यह अध्ययन उपकला आबादी के चयन और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के निषेध के संदर्भ में मोर्सज़ेक एट अल से अलग है। चयन केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त मीडिया (एसएफएम) का उपयोग करके किया गया था, जो उपकला कोशिका प्रसार की अनुमति देता है और मेसेनकाइमल सेल प्रसार को रोकता है। यह अध्ययन Oh और Yi8 की एक रिपोर्ट से उत्पन्न हुआ। इस अध्ययन का उद्देश्य मानव डीएफ से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए उस रिपोर्ट में उपयोग की जाने वाली विधि के विवरण का वर्णन करना था।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं. एकल-कोशिका आबादी की कटाई डीएफ से उपकला कोशिकाओं के सफल अलगाव के लिए आवश्यक है। हमने अपनी परिकल्पना के आधार पर डीएफ से उपकला कोशिकाओं को अलग करने की मांग की कि ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को कोरियाई सरकार (NRF-2017R1C1B2008406 और NRF-2021R1F1A1064350) द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (NRF) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। डॉ ही-येओन बे ने कृपया प्राथमिक संस्कृति के लिए डीएफ प्रदान किया।
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
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