Summary
Diabetisk retinopati er en av de ledende årsakene til blindhet. Histologi, blod-retinal barriere sammenbrudd analyse, og fluorescens angiografi er verdifulle teknikker for å forstå patofysiologien til netthinnen, noe som ytterligere kan forbedre effektiv legemiddelscreening mot diabetisk retinopati.
Abstract
En bakre segment øyesykdom som diabetisk retinopati endrer fysiologien til netthinnen. Diabetisk retinopati er preget av en netthinneavløsning, nedbrytning av blodretinalbarrieren (BRB) og retinal angiogenese. En in vivo rotte modell er et verdifullt eksperimentelt verktøy for å undersøke endringene i strukturen og funksjonen til netthinnen. Vi foreslår tre forskjellige eksperimentelle teknikker i rottemodellen for å identifisere morfologiske endringer i retinalceller, retinal vaskulatur og kompromittert BRB. Retinal histologi brukes til å studere morfologien til ulike retinalceller. Kvantitativ måling utføres også ved retinal celleantall og tykkelsesmåling av forskjellige netthinnelag. En BRB-sammenbruddsanalyse brukes til å bestemme lekkasjen av ekstraokulære proteiner fra plasma til glassvev på grunn av nedbrytning av BRB. Fluorescens angiografi brukes til å studere angiogenese og lekkasje av blodkar ved å visualisere retinal vaskulatur ved hjelp av FITC-dextran fargestoff.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) er en av de mest komplekse sekundære komplikasjoner av diabetes mellitus. Det er også den ledende årsaken til forebyggbar blindhet i befolkningen i arbeidsfør alder over hele verden. I en nylig metaanalyse av 32,4 millioner blinde mennesker var 830 000 (2,6 %) blinde på grunn av DR1. Andelen synstap tilskrevet diabetes rangert som nummer sju i 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnostiseres av vaskulære abnormiteter i det bakre okulære vevet. Klinisk er det delt inn i to stadier – Ikke-proliferativ DR (NPDR) og Proliferative DR (PDR), basert på vaskularisering i netthinnen. Hyperglykemi regnes som den potente regulatoren av DR, da det impliserer flere veier involvert i nevrodegenerasjon4,5, betennelse6,7 og mikrovaskulær8 i netthinnen. Flere metabolske komplikasjoner indusert på grunn av hyperglykemi inkluderer akkumulering av avanserte glykasjonssluttprodukter (AGE), polyolbane, hexosaminvei og proteinkinase-C-bane. Disse veiene er ansvarlige for celleproliferasjon (endotelceller), migrasjon (pericytter) og apoptose (nevrale retinalceller, pericytter og endotelceller) basert på ulike stadier av diabetisk retinopati. Disse metabolske endringene kan føre til fysiologiske endringer som netthinneavløsning, tap av netthinneceller, nedbrytning av blodretinalbarrieren (BRB), aneurisme og angiogenese9.
Streptozotocin (STZ) indusert type-1 diabetes er en veletablert og godt akseptert praksis hos rotter for evaluering av diabetespatogenese og dens komplikasjoner. Diabetogene effekter av STZ skyldes selektiv ødeleggelse av bukspyttkjertel holme β-celler10. Som et resultat vil dyrene gjennomgå insulinmangel, hyperglykemi, polydipsi og polyuri, som alle er karakteristiske for menneskelig type-1 diabetes mellitus11. Ved alvorlig diabetesinduksjon administreres STZ ved 40-65 mg/kg kroppsvekt intravenøst eller intraperitonealt i voksen alder. Etter ca. 72 timer presenterer disse dyrene blodsukkernivåer større enn 250 mg/dl10,12.
For å forstå de fysiologiske endringene i netthinnen på grunn av nevrodegenerasjon, betennelse og angiogenese, bør forskjellige teknikker optimaliseres i eksperimentelle dyremodeller. Strukturelle og funksjonelle endringer i retinalceller og netthinnefartøy kan studeres ved hjelp av ulike teknikker som histologi, BRB-analyse og fluorescensangiografi.
Histologi innebærer studiet av anatomien til celler, vev og organer på mikroskopisk nivå. Det etablerer en sammenheng mellom strukturen og funksjonen til celler / vev. Flere trinn utføres for å visualisere og identifisere de mikroskopiske endringene i vevsstruktur, og dermed sammenligne sunne og syke kolleger13. Derfor er det viktig å standardisere hvert trinn i histologi omhyggelig. Ulike trinn involvert i retinal histologi er fiksering av prøven, trimming av prøven, dehydrering, rydding, impregnering med paraffin, parafininnstøtning, seksjonering og farging (Hematoxylin og Eosin farging)13,14.
I en sunn netthinne styres transporten av molekyler over netthinnen av BRB, sammensatt av endotelceller og pericytter på innsiden, og retinal pigment epitelceller på ytre side. Imidlertid begynner indre BRB endotelceller og pericytter å degenerere under den syke tilstanden, og BRB er også kompromittert15. På grunn av denne BRB-sammenbruddet lekker mange molekyler med lav molekylvekt inn i glasslegemet og netthinnevev16. Etter hvert som sykdommen utvikler seg, lekker mange andre proteinmolekyler (lav og høy molekylvekt) også til glasslegemet og netthinnevev på grunn av homeostaseforstyrrelser17. Det fører til ulike andre komplikasjoner og til slutt makulaødem og blindhet. Derfor, kvantifisere proteinnivået i glasslegemet og sammenligne sunne og diabetikere tiltak kompromittert BRB.
Fluorescens angiografi er en teknikk som brukes til å studere blodsirkulasjonen av netthinnen og choroid ved hjelp av fluorescerende fargestoff. Den brukes til å visualisere vaskulatur av netthinnen og choroid ved å injisere fluorescein fargestoff via intravenøs rute eller hjerteinjeksjon18. Når fargestoffet er injisert, når det først retinal arteriene, etterfulgt av retinal årer. Denne sirkulasjonen av fargestoff er vanligvis fullført innen 5 til 10 min fra injeksjon av fargestoff19. Det er en viktig teknikk for å diagnostisere ulike bakre segment okulære sykdommer, inkludert diabetisk retinopati og choroidal neovascularization20. Det bidrar til å oppdage store og mindre vaskulaturendringer i normale og syke forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologi
Retinal histologi utføres for å visualisere de morfologiske endringene i retinalceller og lag. Ulike trinn, inkludert valg av fixative løsning, fikseringsvarighet, dehydrering og parafinimpregnering, må optimaliseres. Vevsstørrelsen bør ikke overstige 3 mm, da den fixative penetrasjonen blir langsom. Den ofte brukte 4% paraformaldehyden fører til netthinneavløsning selv i det sunne øyet på grunn av den relativt høye osmolariteten til løsningen sammenlignet med vandig humor og gla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfattere ønsker å anerkjenne Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) for støtte til Dr. Nirmal J. Vi vil også takke University Grant of Commission for å gi Junior Research Fellowship til Manisha Malani og Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus for å tilby infrastrukturelt anlegg.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
