Retinal patofysiologisk utvärdering i en råttmodell
Summary
Diabetisk retinopati är en av de främsta orsakerna till blindhet. Histologi, blod-retinal barriärnedbrytningsanalys och fluorescensangiografi är värdefulla tekniker för att förstå näthinnans patofysiologi, vilket ytterligare kan förbättra den effektiva läkemedelsscreeningen mot diabetisk retinopati.
Abstract
En bakre segment ögonsjukdom som diabetisk retinopati förändrar näthinnans fysiologi. Diabetisk retinopati kännetecknas av en retinalavskiljning, nedbrytning av blod-retinalbarriären (BRB) och retinal angiogenes. En in vivo-råttmodell är ett värdefullt experimentellt verktyg för att undersöka förändringarna i näthinnans struktur och funktion. Vi föreslår tre olika experimentella tekniker i råttmodellen för att identifiera morfologiska förändringar av retinala celler, retinal vaskulatur och komprometterad BRB. Retinal histologi används för att studera morfologin hos olika retinala celler. Kvantitativ mätning utförs också genom retinal cellantal och tjockleksmätning av olika retinala lager. En BRB-nedbrytningsanalys används för att bestämma läckaget av extraokulära proteiner från plasma till glasvävnad på grund av nedbrytningen av BRB. Fluorescensangiografi används för att studera angiogenes och läckage av blodkärl genom att visualisera retinal vaskulatur med fitc-dextranfärgämne.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) är en av de mest komplexa sekundära komplikationerna av diabetes mellitus. Det är också den främsta orsaken till blindhet som kan förebyggas i befolkningen i arbetsför ålder över hela världen. I en nyligen genomförd metaanalys av 32,4 miljoner blinda människor var 830 000 (2,6%) personer blinda på grund av DR1. Andelen synförlust som tillskrivs diabetes rankades som sjunde år 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnostiseras av vaskulära abnormiteter i de bakre okulära vävnaderna. Kliniskt är det uppdelat i två steg – Non-Proliferative DR (NPDR) och Proliferative DR (PDR), baserat på vaskulariseringen i näthinnan. Hyperglykemi anses vara den potenta regulatorn för DR eftersom det implicerar flera vägar som är involverade i neurodegeneration4,5, inflammation6,7 och mikrovaskulatur8 i näthinnan. Flera metaboliska komplikationer inducerade på grund av hyperglykemi inkluderar ackumulering av avancerade glykationsslutprodukter (AGEs), polyolväg, hexosaminväg och proteinkinas-C-väg. Dessa vägar är ansvariga för cellproliferation (endotelceller), migration (pericyter) och apoptos (neurala retinala celler, pericyter och endotelceller) baserat på olika stadier av diabetisk retinopati. Dessa metaboliska förändringar kan leda till fysiologiska förändringar såsom näthinneavlossning, förlust av retinala celler, nedbrytning av blod-retinalbarriären (BRB), aneurysmer och angiogenes9.
Streptozotocin (STZ) inducerad typ 1-diabetes är en väletablerad och väl accepterad praxis hos råttor för utvärdering av diabetespatogenes och dess komplikationer. Diabetogena effekter av STZ beror på selektiv förstörelse av bukspottkörtelns öar β-celler10. Som ett resultat kommer djuren att genomgå insulinbrist, hyperglykemi, polydipsi och polyuri, som alla är karakteristiska för human typ 1-diabetes mellitus11. För svår diabetesinduktion administreras STZ med 40-65 mg/kg kroppsvikt intravenöst eller intraperitonealt under vuxen ålder. Efter cirka 72 timmar uppvisar dessa djur blodsockernivåer högre än 250 mg/dl10,12.
För att förstå de fysiologiska förändringarna i näthinnan på grund av neurodegeneration, inflammation och angiogenes bör olika tekniker optimeras i experimentella djurmodeller. Strukturella och funktionella förändringar i retinala celler och retinala kärl kan studeras med olika tekniker såsom histologi, BRB-nedbrytningsanalys och fluorescensangiografi.
Histologi innebär studier av anatomin hos celler, vävnader och organ på mikroskopisk nivå. Det etablerar en korrelation mellan strukturen och funktionen hos celler / vävnad. Flera steg utförs för att visualisera och identifiera de mikroskopiska förändringarna i vävnadsstrukturen och därigenom jämföra friska och sjuka motsvarigheter13. Därför är det viktigt att standardisera varje steg i histologin noggrant. Olika steg som är involverade i retinal histologi är fixering av provet, trimning av provet, uttorkning, rensning, impregnering med paraffin, paraffininbäddning, sektionering och färgning (Hematoxylin och Eosinfärgning)13,14.
I en frisk näthinna styrs transporten av molekyler över näthinnan av BRB, bestående av endotelceller och pericyter på insidan och retinala pigmentepitelceller på utsidan. Inre BRB-endotelceller och pericyter börjar emellertid degenerera under det sjuka tillståndet, och BRB äventyras också15. På grund av denna BRB-nedbrytning läcker många molekyler med låg molekylvikt in i glas- och näthinnevävnad16. När sjukdomen fortskrider läcker också många andra proteinmolekyler (låg och hög molekylvikt) in i glas- och näthinnevävnad på grund av homeostasstörning17. Det leder till olika andra komplikationer och i slutändan makulärt ödem och blindhet. Därför komprometterade KVANTIFIERING av proteinnivåerna i glaskroppen och jämförelse av friska och diabetiska tillståndsåtgärder BRB.
Fluorescensangiografi är en teknik som används för att studera blodcirkulationen i näthinnan och koroid med fluorescerande färgämne. Det används för att visualisera vaskulaturen i näthinnan och koroiden genom att injicera fluoresceinfärgämne via intravenös väg eller hjärtinjektion18. När färgämnet injiceras når det först retinala artärer, följt av retinala vener. Denna cirkulation av färgämne slutförs vanligtvis inom 5 till 10 minuter från injektionen av färgämne19. Det är en viktig teknik för att diagnostisera olika bakre segment okulära sjukdomar, inklusive diabetisk retinopati och koroidal neovaskularisering20. Det hjälper till att upptäcka större och mindre vaskulaturförändringar i normala och sjuka tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologi
Retinal histologi utförs för att visualisera de morfologiska förändringarna av retinala celler och lager. Olika steg, inklusive val av fixeringslösning, fixeringstid, uttorkning och paraffinimpregnering, måste optimeras. Vävnadsstorleken bör inte överstiga 3 mm, eftersom den fixerande penetrationen blir långsam. Den vanliga 4% paraformaldehyd leder till retinalavskiljning även i det friska ögat på grund av lösningens relativt höga osmolaritet jämfört med vattenhaltig humor o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författare vill erkänna Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) för finansieringsstöd till Dr. Nirmal J. Vi vill också tacka University Grant of Commission för att ge Junior Research Fellowship till Manisha Malani och Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus för att tillhandahålla infrastrukturell anläggning.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
