JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

Abstract

הקרנית קריטית לראייה, ומהווה כשני שלישים מכוח השבירה של העין. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית רגישה מאוד למגוון רחב של פציעות שעלולות להוביל לאובדן שקיפות הקרנית ועיוורון בסופו של דבר. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור שקיפות הקרנית ויכולות השבירה. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים והצטלקות. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות. לקראת מטרה זו, מודלים של מורין של פציעת קרנית הוכיחו את עצמם כיעילים לקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. כאן מתואר פרוטוקול ליצירת שחיקה מרכזית של אפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד מועדון גולף קהה. במודל זה, טרפין עגול בקוטר 2 מ”מ, שמרכזו מעל הקרנית, משמש לתיחום אזור הפצע. מועדון הגולף spud משמש בזהירות כדי debride את האפיתל וליצור פצע עגול מבלי לפגוע בקרום מרתף אפיתל הקרנית. התגובה הדלקתית המתקבלת מתרחשת כמפל מאופיין היטב של אירועים תאיים ומולקולריים שהם קריטיים לריפוי פצעים יעיל. מודל פשוט זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי קרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

Introduction

הקרנית היא החלק הקדמי השקוף של שליש מהעין. הקרנית משרתת מספר פונקציות כולל הגנה על המבנים הפנימיים של העין ויצירת מחסום מבני המגן על העין מפני זיהומים1. חשוב מכך, הקרנית חיונית לראייה, ומספקת כשני שלישים מכוח השבירה של העין 2,3. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית חשופה למגוון רחב של פציעות על בסיס יומיומי שעלולות להוביל לשיבוש בתפקוד המחסום שלה, לאובדן שקיפות ולעיוורון בסופו של דבר. אובדן שקיפות הקרנית הוא גורם מוביל ללקוי ראייה ברחבי העולם 4,5. שחיקות קרנית הן סיבה נפוצה לביקורים בחדר המיון (ER), המהווים מחצית מהמקרים הקשורים לעין המוצגים במיון6. על פי הערכות, יותר ממיליון בני אדם סובלים מפציעות הקשורות לעיניים מדי שנה בארצות הברית7. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור השקיפות ויכולות השבירה שלו. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים וצלקותשל 8,9. כמו כן, הפופולריות הגוברת של ניתוחי שבירה מציבה אתגר טראומטי ייחודי על הקרנית10. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות.

לשם כך פותחו מספר מודלים של בעלי חיים של ריפוי פצעי הקרנית 11,12,13,14,15. מודלים של מורין של ריפוי פצעי הקרנית הוכיחו את עצמם כיעילים בקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. סוגים שונים של פצעי הקרנית שימשו בחקר ריפוי פצעי הקרנית, שכל אחד מהם מתאים לחקר היבטים שונים של תהליך ריפוי הפצע. הסוגים הנפוצים ביותר של מודלים של פצעים המשמשים במחקרי ריפוי פצעים בקרנית הם המודלים המכניים והכימיים של פצעים. פצעי קרנית כימיים, הכוללים בעיקר יצירת כוויות אלקליין על הקרנית, שימושיים לחקר כיבים בקרנית, אטימות וניאו-וסקולריזציה13. פצעי קרנית מכניים כוללים פצעי חיטוי (שחיקה) ופצעי כריתת קרטום 14,15,16. קרום מרתף אפיתל שלם או פרוץ של הקרנית מגדיר פצעי כריתה וקרתית דם, בהתאמה. בפצעי חיטוי, קרום מרתף האפיתל נשאר שלם, בעוד שבפצעי כריתת קרטום, קרום המרתף נפרץ עם חדירה בעיקר לתוך הסטרומה הקדמית. פצעי חיטוי הם השימושיים ביותר לחקר אפיתליאליזציה מחדש, התפשטות תאי אפיתל, תגובה חיסונית והתחדשות עצבים בעקבות פציעת הקרנית. פצעי כריתת קרטקומיה, לעומת זאת, שימושיים ביותר לחקר הצטלקות הקרנית14,15.

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל ריפוי פצעי הקרנית הפשוט הזה ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי הקרנית שנפגעו בהקשר של מחלה17.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יוסטון ובמכללת ביילור לרפואה. ההנחיות שפורטו בהצהרת האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) בדבר השימוש בבעלי חיים בראייה ובמחקרי עיניים, בוצעו בטיפול בעכברים ובשימוש בהם. 1. …

Representative Results

איור 3 מראה מיקרוגרף אלקטרוני תמסורת של פצע בקרנית שנוצר עם ספוד מועדון הגולף הקהה, ומדגים כי קרום המרתף האפיתליאלי אכן שלם לאחר פציעה. איור 3: קרום מרתף אפיתל נשאר שלם לאחר ?…

Discussion

מטרת מאמר השיטות הזה הייתה לתאר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל מורין זה שימש לחקר דלקת הקרנית ותרומתה לריפוי פצעים. סוג זה של מודל יכול לשמש לחקר מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית בתנאים פיזיולוגיים רגילים ובפתולוגיות</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון: נתמך על ידי: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., ו- R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), ומענק סיגמא שי בסיוע למחקר (P.K.A.). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות, או סיגמא שי.

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -. S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat’s licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Keywords: Epithelial AbrasionCorneal Wound HealingCorneal InflammationCorneal Wounding ModelFluorescein StainingWound ClosureRe-epithelializationImage Analysis
check_url/kr/63112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image