Summary
我々は、ブタ異所性心臓移植モデルにおける心臓同種移植片全体への治療薬の送達のために、正常温熱 エクスビボ 正気灌流システムを利用するためのプロトコルを提示する。
Abstract
心臓移植は、末期心不全のゴールドスタンダード治療です。しかしながら、利用可能なドナー心臓の数および一次移植片機能障害および移植片拒絶などの合併症によって制限されたままである。心臓移植におけるex vivo灌流装置の最近の臨床的使用は、機能を改善し、有害なレシピエント応答を回避するために、治療介入で心臓同種移植片を治療するためのユニークな機会を導入する。同種移植片全体への治療送達のための翻訳型大型動物モデルを確立することは、心臓移植における新規治療アプローチを試験するために不可欠である。腹腔内位置におけるブタ、異所性心臓移植モデルは、新規介入の効果および移植片拒絶の免疫病理学を評価するための優れたモデルとして役立つ。このモデルはさらに、移植片がレシピエントの循環を維持するために必要ではないことを考えると、ブタの長期生存を提供する。このプロトコールの目的は、移植前に心臓同種移植片全体への治療のエキソビボ送達を達成するための再現可能で堅牢なアプローチを提供し、エキソビボ灌流心臓の生存ヘテロトピック移植を行うための技術的詳細を提供することである。
Introduction
心不全は、米国で推定600万人の成人に影響を与える状態であり、2030年までに800万人の成人に増加すると予測されています1。心臓移植は、末期心不全のゴールドスタンダード治療です。しかし、それはその限界と複雑さがないわけではありません。利用可能なドナー心臓の数、一次移植片機能障害、心臓の拒絶反応、および長期免疫抑制の副作用によって制限されたままである2。これらの制限は、同種移植不全を経験する可能性があり、正常な平均余命を達成するためにその後の再移植を必要とする若いレシピエントにおいて特に重要である。
これらの制限を克服するための理想的な介入は、同種移植片の生存率を改善し、「心臓保護」を与えることができるレシピエントへの移植前に治療薬で心臓同種移植片全体を治療することである。このような介入は、虚血性侮辱、同種移植片拒絶、心臓同種移植血管障害の発生率を最小限に抑え、さらには辺縁同種移植片を修復するために予防的に与えられるであろう。これらのタイプの介入を開発するためのトランスレーショナル研究は、心臓移植片の長期サーベイランスを可能にするために、心臓移植の大型動物モデルを必要とする。腹腔内位置におけるブタ、ヘテロトピック心臓移植モデルは、この目的に理想的であることが証明されている。この位置での心臓移植は、新規療法の効果をテストし、移植片拒絶反応の免疫病理を評価することを可能にする。さらに、ヘテロトピックモデルは、レシピエントのより良い全生存期間、心肺バイパスの要件、およびレシピエントの循環を維持するための移植片の要件がないため、同所性モデルよりも有利である3。
遺伝子、細胞、または免疫療法などの心臓への治療的介入の効果的な送達は、臨床応用に対する重大な障壁である4,5。ex vivo灌流装置によって導入された技術は、移植片を継続的に灌流させ、非機能的ではあるが代謝的に活性な状態に維持することを可能にする6,7,8,9。これは、全身送達の潜在的な副作用を最小限に抑えながら、高度な治療薬で心臓全体を治療するためのユニークな機会を提供します10,11,12,13。治療送達のためにエキソビボ灌流デバイスを利用することの別の利点は、従来の寒冷静的保存法を使用して実現不可能な長期間にわたる冠状動脈循環への薬物の投与を可能にすることである。これにより、移植片14への治療薬のよりグローバルな送達が可能になる。ここで提示したプロトコールを用いて、我々は、アデノウイルスベクター15を用いてブタ心臓移植片全体にホタルルシフェラーゼ遺伝子を送達することに成功した。このプロトコールの目的は、移植前に心臓同種移植片全体への治療の送達を達成するための再現可能で堅牢なアプローチを提供することである。
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Protocol
注:2頭の雌のユカタン豚が選択され、1頭は心臓移植片ドナー、もう1頭はレシピエントとして指定されます。生後6〜8ヶ月、体重約30 kg、互換性のある血液型を持つ豚が推奨されます。このプロトコルの概要を 図 1 に示します。豚の飼育および治療手順は、デューク大学医療センターの動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従って行われます。
エキソビボ灌流装置の作製
- ex vivo灌流装置およびセルセーバー装置を、製造業者のガイドラインに従って使用するために準備する。
- ペーシングボックスと除細動器を用意し、セットアップします。
- 完全血球数(CBC)、基本代謝パネル(BMP)、および動脈血ガス(ABG)をチェックするためのポイントオブケア(POC)検査装置を用意してください。
- 製造業者の灌流溶液にまだ存在しない場合は、製造業者が提供する灌流プライミング溶液に以下の薬物を加える:100mLの25%アルブミン、10mLの200mg / 100mLシプロフロキサシン、1gのセファゾリンナトリウム、2つの5mLバイアルのマルチビタミン注射剤、250mgのメチルプレドニゾロン、10,000IUのヘパリン、および50IUのインスリン。
- エクスビボデバイスプライミング溶液のPOCテストを実行して、電解質レベルが正常な生理学的範囲内にあることを確認します。そうでない場合は、グルコン酸カルシウム、デキストロース、および/または炭酸水素ナトリウムを適宜投与して、治療下電解質またはグルコースレベルを補完する。
- 添加した薬剤でプライミング溶液を添加するには、溶液をスパイクし、溶液を ex vivo 灌流装置に送達するラインを脱気する。
注: ex vivo 灌流装置のプライミング手順については、セクション6に進んでください。
2.ドナーブタにおける麻酔の開始およびIVアクセス
- 豚を8〜12時間絶食させた後、ケタミン(5〜33mg / kg、筋肉内)およびミダゾラム(0.2〜0.5mg / kg、筋肉内)で予備薬を投与し、フェイスマスクを使用してイソフルラン(1〜4%)を投与する。
- ブタを仰臥位に置き、気道を保護するために気管内チューブ(ETT)(内径5.5〜6.5mm)で挿管します。ETTを豚の鼻に結びつけて固定します。テーブルに取り付けられた重いネクタイを使用して四肢を配置します。
- 麻酔下にある間の乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を塗布する。
- 静脈内(IV)カテーテル(20-22 G)を耳静脈に入れます。
- メンテナンスを開始するIV液(10mLの乳酸リンゲル溶液・(kg·h)-1)。
- 筋肉内(IM)ブプレノルフィン0.005-0.01mg / kgを鎮痛のために投与する。
3. バイタルサインとセントラルライン設定
- 10mL·(キログラム・分)-1 およびイソフルラン(1〜3%)による毎分10〜15回の呼吸速度は、反射が不在であり、心拍数(>60 bpm、<100 bpm)および血圧(収縮期血圧>90 mmHg、<130 mmHg)が生理学的範囲内にとどまるように、手順全体を通して維持される。
注:麻痺薬の追加はオプションです。 - 手術中、酸素飽和度と心拍数を継続的に監視します。
4. ドナーブタの胸骨切除中央値
- 胸骨をマヌブリウムから剣状突起に触診する。滅菌外科用マーカーを使用して正中線にマークを付けます。バリカンで部位の毛髪を剃り、4%クロルヘキシジンを使用してその部分を滅菌し、合計3回の滅菌を行います。即時の手術部位の周りに滅菌外科用ドレープを塗布する。
注:外科医は、アルコールまたはヨウ素ベースの洗浄で手と腕を洗い、滅菌ガウンと手袋を着用する必要があります。 - ブタのサイズに応じて、10番のブレードを使用して、マヌブリウムから剣状突起まで、20〜30cmの切開を行います。
- 電気焼灼を使用して胸骨から剣状突起に大胸骨を分割し、胸骨の正中線に沿ってこれを行うように注意してください。胸骨まで下がったら、正中線を得点し、重いはさみで割って剣状突起から胸骨切除を開始します。
- 重いはさみで胸骨切除セファラドを伸ばします。各切断後、指のスイープを使用して心臓を胸骨から鈍く分離します。このようにして、マヌブリウムを通して胸骨切除術を完了する。
- 胸骨切除を完了した後、切断された骨縁部に電気焼灼を加えることによって止血を達成する。
- 胸骨リトラクターを配置し、手術野の露出を最適化するためにそれを開きます。電気焼灼で胸腺を識別して除去する。横隔膜から大動脈まで縦方向に心膜に入ります。5-6サイズを使用して心膜クレードルを作成します:2-0、シルク縫合糸。
5.ドナーブタの心停止および心臓切除術
- 大動脈と肺動脈(PA)の間の組織を完全に分割し、大動脈弓と腕頭筋胴体の位置を視覚化して、大動脈クロスクランプの適切な配置を容易にします。
注:上行大動脈は、ブタ対ヒトでははるかに短い。 - 上大静脈(SVC)をはさみと鈍い解剖を用いて円周遊離させる。2つを渡す、サイズ:0、SVCの周りのシルクネクタイ。
- はさみと鈍い解剖を用いて下大静脈(IVC)を周方向に遊離する。同様に、IVCの周りに2つの0シルクネクタイを渡します。
- 上行大動脈にUステッチ、サイズ:4-0、ポリプロピレン縫合糸を塗布する。
- 財布紐、サイズ:4-0、ポリプロピレン縫合糸を右心房(RA)に適用します。
- 300U / kgの初期用量を用いてヘパリンIVのボーラスを投与する。
- 小児用4-Fr大動脈根カニューレを挿入し、以前に配置したUステッチで固定します。カニューレを脱気し、ルンメル止血帯で所定の位置に固定します。
- 大動脈根カニューレを心筋麻痺チューブに接続し、チューブをデルニド心麻痺で洗い流した後にします。チューブ内の気泡を除去するために必要な量で洗い流してください。
注:この時点では、灌流チームとのコミュニケーションが心停止を正しく実行することが重要です。- 灌流器がセルセーバー使い捨て品を滅菌方法で設置し、製造元の推奨に従ってデバイスをプライミングし(セクション6を参照)、採取した血液を処理する準備ができていることを確認します。
- セルセーバー心臓切除術(洗浄後に血液が保存されるセルセーバー装置に取り付けられたプラスチック容器)が10,000Uのヘパリンで準備ができていること、および心臓切除術が吸引に接続され、-150mmHgの圧力を超えないことを確認します。
注:これは赤血球の溶血を避けるためです。
- 以前に配置した財布紐内に右耳切開術を作成し、24Fr静脈カニューレをRAに挿入し、Rummel止血帯で固定します。
- 静脈カニューレをセルセーバー心臓切開術に接続された滅菌吸引ラインに接続し、約1〜1.3Lの血液を採取する。次に、大動脈クロスクランプを適用し、クランプが上行大動脈を完全に閉塞することを慎重に確認します。500mLのデルニド心筋麻痺を、圧力バッグを用いて100〜150mmHgの圧力で根元に投与する。
注:心臓は白熱し、逮捕されます。 - 心臓に滅菌アイススラッシュを置きます。
- 心筋麻痺が解消されたら、大動脈根カニューレとRA静脈カニューレを取り外し、財布紐縫合糸を結びます。
- IVC、接合静脈のすぐ近位にあるSVC、無名動脈のちょうど遠位にあるアーチのレベルの大動脈、分岐部のメインPA、冠状動脈洞に入るときの左接合静脈。
注:豚は冠状動脈洞に排出する左の接合静脈を持っています。 - 肺静脈を識別し、サイズでそれらを滑らかにします:2-0、シルクネクタイまたは大きなサイズのクリップ。LV通気口を挿入するために1つの肺静脈を開いたままにしておきます。
- 胸から心臓を取り出し、滅菌アイススラッシュの入った容器に入れます。
- 心臓をバックテーブルに移動し、 エクスビボ 灌流装置上に配置するための移植片を準備する。
6. ドナー血液の洗浄と エキソビボ 灌流装置のプライミング
注:このステップは、灌流液に導入されたときに治療薬の送達を中和する可能性のある成分をドナー血清から除去するために必要です。ドナー心臓の移植中にこのステップを実行して、同種移植片虚血時間を最小限に抑える。
- セルセーバープライムと洗浄サイクルを完了します。
- 製造元の指示に従って、使い捨てコンポーネントをデバイスに取り付けます。
- プラズマライトAをスパイクし、デバイスのプライム機能を選択することによって、セルセーバーデバイスを プライム します。血漿液Aをドナーブタから採取した血液の量と同じ量で1:1の形で加えます。
注:デバイスがプライミングサイクルを完了すると、血液を添加する準備が整います。ドナーブタからの血液を追加する方法については、セクション5.9-5.11を参照してください。 - 血液がデバイスに入ったら、セルセーバーデバイスの 洗浄サイクル を選択します。
注:このプロセスの間、血液を遠心分離し、血漿液Aを導入して血液を洗浄します。このステップは、血液を濃縮し、洗浄する。
- 洗浄した血液を採血バッグに移し、 エキソビボ 装置に移す。
- 洗浄した血液を、製造業者のガイドラインに従って エキソビボ 灌流装置に加える。
- エキソ ビボ マシンのプライミング中に水中の500mLの5%デキストロースに0.25mgのエピネフリンおよび30IUのインスリンを注入することによってエピネフリン溶液を調製する。溶液をスパイクし、溶液を エキソビボ デバイスに送達するラインを脱気する。
- 10,000Uのヘパリンを エキソビボ 灌流装置に加える。
- 血液を再構成するために5%アルブミンを加える。
注:デバイスに添加される5%アルブミンの量は、セルセーバーデバイスによって除去される血漿の量に等しい。これは、生理学的腫瘍性圧力およびヘマトクリットを達成するのを助けるために行われる。 - ポンプをオンにして1-1.5 L/minで流れ、透明な素数、薬物、および血液をリザーバに投与して回路をプライムします。ポンプの流れをオンにして、灌流モジュールを通してプライムを循環させた後、回路のラインに空気がないことを確認してください。
注:最終的な維持溶液容量は、洗浄された血液の容量に加えて1000mLです。 - POC試験装置を用いてPOC化学および乳酸塩のベースライン灌流液を得る。必要に応じて電解質を補充する。
- 100mg / dLの最小グルコースレベルを維持するのに十分な デキストロース を加える。
- 7.4の最小pH目標を維持するために十分な 重曹 を加える。
注:重要なことに、添加された炭酸水素ナトリウムは灌流液から除去することはできません。過剰なナトリウムレベルは、心臓が浮腫性になることに寄与し、避けなければならない。心臓が再活性化時に基礎赤字を修正し始めるので、基本赤字を治療するときは注意が必要です。 - 0.8 mmol/Lの最小イオン化カルシウムレベルを維持するために十分な グルコン酸 カルシウムを加える。
- 温度を37°Cに設定してください。
- ガス流量を150mL/minに設定し、必要に応じて調整して生理学的pCO2レベルを達成します。
- 平均動脈圧(MAP)目標を60~70mmHgに設定します。
- ポンプの流れを0.6 L/minに下げます。
7. ドナー心臓のバックテーブル準備と心臓の再生
- SVCを監督する。4つの誓約されたサイズ:4-0、ポリプロピレン縫合糸を単純な水平マットレス様式で遠位大動脈の内側、カットエッジの5mm下に置き、それらを結び付けます。
- 4、サイズ:4-0、誓約された大動脈縫合糸を掲げながら、大動脈コネクタを大動脈に挿入し、大動脈の周りに臍帯テープを結んでコネクタを固定する。
- サイズ:4-0、ポリプロピレン製の財布紐をメインPAの遠位カットエッジの周りに配置します。PAカニューレを挿入し、財布の紐の端を結び付けてカニューレを固定します。
- 準備した移植片をバックテーブルから エクスビボ 灌流装置に取り出し、大動脈コネクタを装置に接続します。心臓をデバイスに固定する前に、大動脈/大動脈コネクタを必ず空気抜きにしてください。
- 灌流クロックを開始し、 ポンプ流量 を 0.6L/min付近に維持し、 温度 設定点を 34°Cまで下げます。
- エピネフリンを開始し、メーカーの推奨事項に従ってメンテナンスドリップを開始します。
- PAカニューレをデバイスのPAコネクタに接続し、ネクタイで固定します。
- 左心室(LV)の通気口ドレーンを、縛られていない肺静脈を通って左心房に入り、僧帽弁を横切ってLVに入ります。通気口を1本のステッチで所定の位置に固定して適切に固定します。
- LVフリーウォールに2本の心臓ペーシングリード線を配置します。
- 乳酸塩、ABG、CBC、BMPを1時間ごとにチェックしてください。カリウム、50%デキストロース、およびカルシウムを必要に応じて投与して、正常な生理学的レベルを維持します。
注:乳酸塩に基づく適切な灌流を確立するために、早期安定化中により頻繁な乳酸塩サンプリングが適切であり得る。 - ペーシングが必要な場合は、心室ペースを10mAで毎分80拍に設定します(心房ペーシングは通常利用されません)。
- 除細動が必要な場合は、デバイスの温度が34°Cに達した後、10 Jから開始 します。
注:目標総平均流量は600mL/分、冠状動脈平均流量は400mL/分です。
8. 治療薬の投与
- 無菌の方法で治療をシリンジに引き出します。
- 滅菌3mLシリンジを使用して心麻痺ポートを脱気し、ポートから血液を採取します。治療が大動脈根に直接導入されるように、治療を心麻痺ポート(または同等のもの)に投与する。
- ポートを放映解除するときは、ステップ8.2で採取した血液の量でポートをフラッシュします。空気を流さないように注意してください。
注:これは、治療が心臓の大動脈根に投与されることを確実にするためである。
注: このセクションは、以前に Bishawi らで詳細に説明されています 。 ルシフェラーゼ発現15のためのウイルスベクターを導入する。 - 治療薬を導入した後、2時間デバイス上の移植片を灌流する。
9.レシピエントの準備および血管曝露を伴う開腹術
- 心臓同種移植片がデバイスに固定され、治療が回路に導入されたら、レシピエントブタのセクション2に記載されているように、麻酔の誘導および術前準備を開始する。
- 免疫抑制薬の注入を開始する:手順全体を通してゆっくりとした点滴注入としてシクロスポリン50mg / kg合計およびメチルプレドニゾロン1g IVボーラス。
- 抗生物質を投与する:エンロフロキサシンIM(5mg / kg)およびセファゾリン1g IVボーラス。
- フォーリーカテーテルを膀胱に挿入します。
注:膀胱を減圧することは、外膜大動脈およびIVCの最適な曝露を得ることを助ける。 - 無菌の外科的マーカーを使用して、中腹部から恥骨までの腹部正中線にマークを付けます。バリカンで部位の毛髪を剃り、4%クロルヘキシジンを使用してその部分を滅菌し、合計3回の滅菌を行います。即時の手術部位の周りに滅菌外科用ドレープを塗布する。
注:外科医は、アルコールまたはヨウ素ベースの洗浄で手と腕を洗い、滅菌ガウンと手袋を着用する必要があります。 - 10枚の刃を使用して皮膚を切開し(20〜30cmの切開)、電気焼灼術に切り替えて筋膜まで解剖します。
- 2つのコーチャークランプを使用して筋膜と腹膜を持ち上げ、メッツェンバウムはさみを使用して腹腔に小さな切開(1cm)を慎重に行います。
- 電気焼灼法を用いて切開部の全長にわたって腹膜開口部を伸ばし、下にある内臓を保護するために指を下に置きます。バルフォアリトラクターを配置して露出を最適化します。小腸を頭蓋に、濡れたタオルで引っ込めます。
- 腎臓よりも劣る後腹膜腔を、尿管を特定し、傷害を避けることに注意して開く。
- 解剖を腹部大動脈とIVCまで運びます。中型および大型のクリップでリンパ管を鍛える。
- 容器を円周方向に解剖し、各容器の周りに大きなサチンスキークランプを収めるのに十分な大きさのセグメントを露出させます。大動脈の後部から出てくる腰椎動脈枝の混乱を避けるために注意してください。大動脈およびIVCの周囲に2つの血管ループを、曝露の近位端および遠位端に配置する。
10.最終的な逮捕と エクスビボ 灌流装置からの心臓の除去
- 2時間の エキソビボ 灌流の終わりに、ヒータークーラーマシンを エキソビボ 装置に接続します。ヒータークーラーの温度を34°Cに設定します。
- 無菌で空気のない方法で、脱気心筋麻痺送達ラインを大動脈アクセスポートの ex vivo デバイスに接続します。
- エキソビボ装置上の温度設定点をオフにする。
- ヒーター - クーラーの温度を 24 °C に下げ、ポンプ流量を減らして MAP を 60 ~ 70 mmHg (通常はポンプ流量を 1 L/分から 0.9 L/分まで変化) に維持します。
- ex vivo灌流装置の温度測定値が24-26°Cに達したら、ヒータークーラー温度をさらに14°Cに下げ、ポンプ流量をさらに100mL/min減少させます。
- 温度が 14〜16°Cに達したら、PAカニューレをPAポートから取り外し、順行デルニド(500mL)の送達を開始し、AOラインバルブを閉じ、ポンプを停止し、AOベントラインを素早くクランプする。
注:心筋麻痺送達圧力は、 ex vivo デバイスモニターに表示される45〜65mmHgの平均送達圧力を維持するために滴定する必要があります。 - PAカニューレと大動脈コネクタを取り外し、ペーシングワイヤーを切断することによって、 エクスビボ 灌流装置から心臓を取り外す。
- 滅菌アイススラッシュで満たされたバケツに心臓を置きます。
- バックテーブル上で、LVベントが挿入された肺静脈/左耳道切除術をオーバーソーイングします。大動脈の遠位側面のトリム(1または2mm)およびカニューレへの付着が組織を粉砕した可能性があるPAをトリムする。
注:心臓は現在、腹腔内、ヘテロトピック移植の準備ができています。
11. 心臓移植片の異所性移植
- サチンスキークランプを配置する前に、レシピエントブタに300U / kgのIVヘパリンを投与する。
- IVCにサチンスキークランプを置き、11ブレードとポットのはさみを使用して〜1.5cmの縦静脈切除術を作成します。
- 移植片PAを、ランニング、サイズ:4-0、ポリプロピレン縫合糸を用いてエンドツーサイド方式でレシピエントの腎下IVCに吻合する。最初に吻合の内側部分を行い、吻合の外側部分を完了する前に、中断された縫合糸で必要に応じて補強する。
注:PAからIVCへの吻合が最初に行われ、大動脈から大動脈への吻合が最後に行われ、大動脈閉塞の持続時間が短縮されます。 - 大動脈にサチンスキークランプを置き、11枚の刃とポットのはさみを使用して約1.5cmの縦方向の大動脈切除術を作成します。
メモ: クランプを取り付ける前に ABG を入手してください。クランプ解除直後に再確認し、15〜30分後にもう一度チェックして、レシピエントの虚血性傷害を示す高カリウム血症、高乳酸血症、または酸性血症の変化を評価します。 - 移植大動脈をレシピエントの腎下大動脈にエンドツーサイド方式で吻合し、ランニング、サイズ:4-0、ポリプロピレン縫合糸を使用する。最初に吻合の内側部分を行い、吻合の外側部分を完了する前に、中断された縫合糸で必要に応じて補強する。
- 心臓を再灌流させるためにサチンスキークランプを取り外します。まず、IVCクランプを取り外し、続いて大動脈クランプを取り外します。
- 18Gアンジオカスを移植片のLV頂点に配置して脱気する。完了したら、血管炎を取り外し、誓約された縫合糸で部位を閉じます。
- 吻合に出血がないか慎重に確認してください。
- 吻合に緊張がなく、血管のねじれがないように、心臓を右の後腹膜腔に慎重に配置します。小腸を交換してください。
12. 開腹手術の閉鎖
- ループ状で筋膜を閉じます, サイズ: 0, 切開部の両端から開始し、中央で結ばれて実行方法でマクソン縫合糸.腸への怪我を避けるために注意してください。
- 深い真皮層をサイズ:2-0、ビクリルをランニングファッションで、皮膚をサイズ:4-0、モノクリルをランニングファッションで閉じます。
- 皮膚切開部をきれいにし、皮膚の接着剤を塗布する。
13. 術後治療と安楽死
- 手術の完了後、イソフルランの流れを止め、筋肉の緊張と神経筋反射(角膜反射、痛みを伴う刺激への離脱、嚥下)の戻りについてブタを監視します。
- これらの機能の回復を確認した後、機械換気をオフにし、自然呼吸を観察してください。自発呼吸がある場合は、気管内チューブを取り外します。存在しない場合は、気管内チューブを機械的換気に再接続します。
- 豚を手術台から隔離されたエンクロージャに移し、そこでバイタルサイン(直腸温度、血圧、心拍数)を注意深く監視します。必要に応じて加熱ランプを使用して豚を温めます。低血圧(収縮期血圧<100mmHg)の設定で乳酸リンゲル溶液の250mLのIV流体ボーラスを提供する。ブタが胸骨の臥位を維持でき、バイタルサインが完全に正常化されるまで、ブタを監視し続けます。
注:動物は十分な意識を取り戻すまで放置されません。さらに、動物は完全に回復するまで他の動物と一緒に戻されません。 - 疼痛管理のために、ブプレノルフィン(徐放性)皮下注射0.12mg / kgの1回投与を72時間の鎮痛剤に投与する。
- 実験期間の終わりに、ネイティブ(胸部)心臓および同種移植片(腹部)心臓の移植のためにブタを安楽死させる。
- 手順については、セクション2および3に記載されているようにブタを準備します。各心臓を逮捕するためのデルニドの2つのバッグと2つの心筋麻痺ラインを準備します。
- セクション4で説明したように胸部心臓を露出させます。完了したら、セクション9に記載されているように開腹手術を行います。
- 大動脈 - 大動脈およびPA-IVC吻合が露出したら、レシピエント大動脈にサチンスキークランプを置き、レシピエントIVCに別のクランプを配置して、同種移植片を全身循環から単離する。
- 小児4-Fr大動脈根カニューレを同種移植片の大動脈根に挿入し、心麻痺ラインをカテーテルに接続します。500mLのデルニド心筋麻痺を、圧力バッグを用いて100〜150mmHgの圧力で根元に投与する。注入が開始された後、メッツェンバウムはさみを使用して、PA-IVC吻合のレベルで2cmの切開を行い、同種移植片を通気する。
- 同種移植片が逮捕されたら、メッツェンバウムはさみを使用して大動脈 - 大動脈吻合およびPA-IVC吻合の残りのレベルで切除することによって、同種移植片を植え付けるために進む。サチンスキークランプを取り外さないでください。
- セクション5で説明したように胸部心臓の除去を続行します。
注:唯一の有意差は、肺静脈を慎重に結紮する必要はなく、代わりに心臓切除術を行う際にメッツェンバウムはさみを使用してひどく解剖できることです。
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Representative Results
このグループは、研究デザインに応じて、ここに提示されたプロトコルに従って5〜35日間、9匹のブタを首尾よく生存させました。このプロトコールを受けた10頭のブタのうち、外科的合併症で早期に死亡したのは1頭だけで、90%の生存率が得られました。 図2 に実証された、ブタの腹腔内位置に移植された異所性心の構成図である。同種移植片の吻合部位を決定するときは、吻合の緊張またはねじれを最小限に抑える部位を選択する。これにより、吻合物が適切に治癒し、同種移植片が最適な灌流および血液の排液を受けることを確実にする。
正常温熱エクス ビボ 灌流装置上で灌流されている心臓同種移植片の代表的な画像を 図3に示す。 図4 は、成功した実験中に得られた代表的な灌流パラメータ(循環流速、大動脈圧、心拍数、温度、混合静脈酸素飽和度、およびヘマトクリット)を概説する。ここで実証されたパラメータ値を達成できないと、移植後の同種移植片機能の低下につながる可能性があります。 図5 は、移植成功から35日後の腹腔内ヘテロトピック心臓 の画像をその場で示している 。治療的送達のためにここに提示されるプロトコールを使用することの有効性の代表的な結果は、このグループ15によって以前に実証された。心臓同種移植片(n=3)を、ルシフェラーゼ用導入遺伝子を担持したアデノウイルスベクターで処理した灌流液で灌流した。遺伝子発現は、治療および移植の5日後に同種移植片内でグローバルかつ堅牢であることが証明された。 図6 は、ルシフェラーゼタンパク質活性のアトラスを示し、レシピエントの胸部心臓と比較して、外植された心臓同種移植片の各領域からの活性の平均フォールド変化として提示される。
図1:正常温熱エキソビボ正気灌流を用いた心臓同種移植片全体への治療的送達のためのプロトコール概略図。(b)血液をセルセーバー装置を用いて洗浄し、ドナー血清から任意の治療中和成分を除去する。(C)心臓同種移植片を正常温熱式エクスビボ灌流装置に装着し、2時間灌流する(D)同種移植片が装着された直後に、目的の治療薬を灌流液に加える。(e)割り当てられたエキソビボ灌流期間の後、同種移植片を腹腔内、異所性位置でレシピエントブタに移植する。この図は15 から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腹腔内位置におけるブタ異所性心モデル。 同種移植片を腹腔内位置に移植し、レシピエントのネイティブ心臓を自然な位置に留まらせる異所性心モデルの図。同種移植片の肺動脈は腎下大静脈に吻合され、同種移植片の大動脈はレシピエントの腎下大動脈に吻合される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: エキソビボ 灌流装置上の心臓同種移植片。 心臓同種移植片を正常温熱の エキソビボ 灌流装置に取り付け、レシピエントへの移植前に2時間治療注入灌流液と灌流する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)肺動脈(青)、大動脈(緑)、冠状動脈(赤)から測定された循環流速。(b)代表的な大動脈圧測定値:平均圧(青色)、収縮期圧(赤色)、拡張期血圧(緑色)。(c)エクスビボ灌流中の心臓同種移植片の心拍数。(d)エキソビボ灌流中の心臓同種移植片の温度を記録した。(e)灌流期間中の灌流液から測定したSvO2の値を示す。(f)灌流期間中の灌流液から測定したヘマトクリット値。略語: hct = ヘマトクリット;SvO2=混合静脈酸素飽和度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:レシピエントに移植された心臓同種移植片。 術後35日目に心臓同種移植片を移植時に治療で治療した。ドナーは、受信者との完全な SLA マッチとして選ばれました。略語:SLA=ブタ白血球抗原。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:心臓同種移植片の形質導入後のルシフェラーゼ活性。 提示されたのは、ルシフェラーゼ導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターで形質導入された3つの心臓同種移植片の結果である。実証されたのは、心臓同種移植片の各領域におけるルシフェラーゼタンパク質活性の平均フォールド変化である。この図はBishawiらから修正されている 。15. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
心臓移植におけるエクスビボ灌流中の治療薬の送達は、同種移植片を修正し、移植転帰を潜在的に改善する戦略を提供する。ここで提示されるプロトコールは、最先端の正常温熱エキソビボ正気灌流保存を組み込み、同種移植片への細胞、遺伝子、または免疫療法の単離送達を試験する有望な可能性を提供する11、12、13。今日まで、心血管疾患および末期心不全に対するこれらの推定療法のための心臓送達技術は、全身投与、カテーテル法による冠状動脈内灌流、および直接心筋内注射に依存してきたが、これらはすべて心筋送達の点で悪い結果を達成してきた5,16。我々は以前、移植前のエクスビボ灌流中にウイルスベクターを灌流液に投与した場合、心臓同種移植片全体に対するレポーター遺伝子の堅牢でグローバルな発現を実証していた15。これは、治療のグローバルな発現および効果が同種移植片全体の所望の「心臓保護」を達成するために同種移植片のすべての領域に達するべきである心臓移植の文脈において特に重要である。このプロトコールは、治療薬について伝統的に記載された投与経路を用いて以前に達成されていなかった方法でこれを達成する。
このプロトコルには、強調すべきいくつかの重要なステップがあります。(1)ドナーからの心臓の調達中の失血を最小限に抑えるために、あらゆる予防措置を講ずる必要があります。灌流装置が適切な流量を達成するためには、ドナーから少なくとも1Lの血液を達成する必要があります。(2)正常温熱 エキソビボ 正気灌流を用いた治療送達のためには、心臓への治療の送達に悪影響を及ぼす可能性のあるドナー血清中の中和成分を除去するために、灌流液に添加する前にドナー血液を洗浄する必要がある。(3)致命的な不整脈を避けるために、心麻痺の逮捕後までドナーの心臓の解剖を最小限に抑える。(4)灌流装置に治療薬を導入する場合、懸濁液の完全な送達を確実にするために、大動脈根に最も近いポートを介して導入し、常にポートをフラッシュすることが重要です。これは、回路内の酸素供給器またはチューブに対する治療の潜在的な損失を最小限に抑え、移植片が可能な限り高い治療濃度を受けていることを確認するためである。(5)最後に、移植片移植部位を選択する際には、その場所が吻合の緊張の可能性を最小限に抑え、血管/吻合のねじれがないことが重要です。
また、ブタを豚白血球抗原(SLA)型(すなわち、ブタ主要組織適合性複合体、MHC)とし、細胞表面クラスI(SLA-1、SLA-2、およびSLA-3)および/またはクラスII(DRおよびDQ)抗原を含むSLAハプロタイプ間で適切なマッチング/不一致の程度を、研究者のニーズに基づいて選択することも推奨されます(前述のようにSHによって実施されたSLAタイピングは、タイピングプライマーパネルに若干の変更を加えて)17、18。例えば、ブタがすべてのSLA抗原にわたって一致することを保証することは同種移植拒絶反応のリスクを最小限に抑え、一方、すべてのSLA抗原にわたって不一致を有するブタを使用することは同種移植拒絶反応の発生率を最大化する。
このモデルの限界は、心臓移植片に対する免疫学的効果の研究を可能にする一方で、介入後に心血管系をサポートする移植片の能力の完全な評価を可能にしないことです。それを達成するためには、移植片を同所的に移植する必要があるであろう。しかし、大型動物モデルにおける同所性移植は、関連する死亡率が高く、心肺バイパス3を必要とする。このモデルの別の制限は、移植片への有効な遺伝子送達を行うための エキソビボ 灌流装置へのアクセスの制限である。これらの装置が臓器移植の分野でより利用可能になるにつれて、アクセスの改善が期待される。さらに、非商用の装置は、実験目的のための選択肢であり得る。
心臓移植は、レシピエントへの移植前に エクスビボ 灌流を介して治療薬を同種移植片に導入できるユニークな環境を提供します。 エキソビボ 灌流装置の使用は、移植片が、従来の寒冷静的貯蔵を使用して安全であるものよりもはるかに長い期間、ドナーからレシピエントへ輸送中であることを可能にする6。この延長された灌流期間は、治療薬の効果的な単離送達を可能にする。このモデルは、治療薬の前臨床動物試験と変革的臨床療法の間の翻訳ステップとして機能します。
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Disclosures
Paul LezbergはTransMedics, Inc.に雇用されており、Carmelo MilanoはTransMedics, Inc.から異トピック心臓移植手術に資金を提供するための金銭的贈り物を受け取りました。Michelle Mendiola Pla は T32HL007101 によってサポートされています。他の著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
デューク・ラージ・アニマル・サージカル・コアとデューク・パーフュージョン・サーフュージョン・サービシズには、これらの処置中の支援に感謝します。また、Paul LezbergとTransMedics, Inc.のサポートにも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
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